外周血中循环肿瘤细胞检测通用要求（征求意见稿）.docxVIP

T/CEACXXXX—2024

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外周血中循环肿瘤细胞检测通用要求

1范围

本文件规定了外周血中循环肿瘤细胞检测的方法原理、试剂材料和仪器设备、样本采集与处理、测定结果、质量控制与安全管理。

本文件适用于外周血中循环肿瘤细胞的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

外周血peripheralblood

在体内循环系统中的血液，包括动脉血和静脉血，是进行循环肿瘤细胞检测的主要样本来源。

3.2

循环肿瘤细胞circulatingtumorcells,CTC

从原发灶或转移灶脱落进入外周血中的肿瘤细胞，在肿瘤的转移和复发过程，发挥着重要作用，是液体活检技术中的重要检测对象。

4方法原理

基于免疫学和形态学相结合的方法，采用微孔滤膜芯片，将CTC分离或分离富集后染色成像，根据癌细胞形态学的传统认知，如细胞体积大、畸形、染色质异常、核仁体积大和核仁数目多等特点，在数字荧光显微镜下进行肿瘤细胞特征性病理形态学检测。

5试剂材料和仪器设备

5.1试剂材料

检测所需的试剂材料包括但不限于：——CTC富集滤膜芯片：

1)微孔滤膜，直径25mm聚碳酸酯膜，随机分布9000个直径8μm微孔；

2)定量滤纸，剪成长宽各2.5cm方块状；

3)滤膜芯片盒：制作长宽各5cm，深1.5cm方形塑料材质盒子，分盒底和盒盖；盒盖和盒底接触部分四周有卡槽，使盒底和盒盖能结合紧密；盒盖中央制作直径1.5cm孔，孔周边结构平整，孔内侧周边向内微凸起，以便粘贴滤膜；在滤膜芯片盒内填充定量滤纸达到盒上沿，在盒盖孔内侧凸起处放置密封圈，再在密封圈上放置微孔滤膜，然后把盒盖扣在盒底座上，完成滤膜芯片盒的制作；

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——红细胞裂解液，pH为7.2～7.4；——1%甲醛溶液；

——磷酸缓冲液（PBS）：浓度为1×PBS（0.01mol/L）,pH为7.2～7.4；——细胞固定液：甲醇、丙酮、多聚甲醛；

——细胞封闭液：PBS（含0.5%～10%BSA或小牛血清），pH为7.2～7.4；——细胞膜与细胞核膜通透液：曲拉通X-100；

——细胞洗涤液：PBS（含吐温-20），pH为7.2～7.4；

——染色液1：标记绿色荧光的CK8、18、19和Vimentin单克隆抗体以及标记红色荧光的核仁蛋

白单克隆抗体的PBS稀释液，稀释倍数根据各实验室探索的条件；——染色液2：DAIP染液，稀释倍数根据各实验室探索的条件；

——载玻片：规格为25mm×75mm,厚度为1mm～1.2mm；

——盖玻片：规格为22mm×22mm,厚度为0.13mm～0.16mm；——封片胶。

5.2仪器设备

检测所需的仪器设备包括但不限于：——水浴锅：RT+5℃~99℃;

——数字荧光显微镜。

6样本采集与处理

6.1样本采集

6.1.1血样采集前应向患者解释清楚检测的目的和方法，消除其顾虑。

6.1.2血样采集前一天，患者应保持清淡饮食，避免饮酒，以免影响检测结果。

6.1.3血样采集时应避免患者情绪紧张，以减少应激反应对样本的影响。

6.1.4血样采集环境应保持清洁，采血器具应无菌，以避免样本污染。

6.1.5采样对象应为已确诊的肿瘤患者，或疑似存在肿瘤转移的患者。

6.1.6采用静脉采血的方式，使用无菌技术采集患者外周静脉血，常规采集静脉EDTA抗凝血5～10mL。为避免针头穿刺带入上皮细胞污染，一般采集两管血液，一管用于CTC检测，另一管用于其他实验。

6.1.7血液样本应在4℃~8℃环境下保存，72h内进行CTC检测。6.2样本处理

样本处理按如下步骤进行：

b)在CTC富集滤膜芯片上加入1.5mL血液，等待血液过滤完毕；

c)加入1mL红细胞裂解液，等待过滤完毕；

d)加入1mL1%甲醛溶液，等待过滤完毕；

e)加入1mLPBS，过滤完毕后，拆开盒子，取出微孔滤膜放入六孔板中，在孔中加入1mL细胞固定液，室温固定10min。吸出废液；

f)加入1mL封闭通透液，37℃10min，吸出废液；

g)加入500μL染色液1，37℃40min，吸出废液，

h)加入500μ