伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型三重荧光PCR检测方法.pdf

伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型三重荧光PCR检测方法

1范围

本文件规定了伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型三重荧光RT-PCR检测方法操作规程。

本文件适用于伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的鉴别诊断。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541动物疫病实验室检验采样方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

三重荧光PCRTriplexrealtimePCR

三重荧光聚合酶链式反应。

3.2

Ct值Cyclethreshold

每个反应孔内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PRV：伪狂犬病毒（PorcinePseudorabiesVirus）

PPV：猪细小病毒（PorcineParvovirus）

PCV-2：猪圆环病毒2型（PorcineCircovirustype2）

FAM:6-羧基荧光素(6-Carboxyfluorescein)

Cy5：荧光发光基团

Hex：六氯-6-甲基荧光素（6-Hexachlorofluorescein）

BHQ：荧光淬灭基团

1

5仪器和设备

多通道荧光PCR仪、生物安全柜、冰箱（2℃～6℃和-20℃）、台式冷冻离心机、组织匀浆机、漩涡

器、移液器及吸头（至少包括10μL、200μL和1000μL三个量程）。

6试剂和材料

6.1病毒总核酸提取试剂TIANampVirusDNA/RNAKit或者其他等效核酸提取试剂。

6.2IQPowermixPCRkit或者其他等效多重荧光PCR试剂。

6.3无水乙醇（分析纯）和75%乙醇（用新开启的分析纯无水乙醇和DEPC处理水配制）及实验用水按

照GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》规定使用，-20℃预冷。

6.4阳性对照

含伪狂犬病毒（PRV）gE基因的体外重组质粒、含猪细小病毒（PPV）NS1基因的体外重组质粒、含

猪圆环病毒2型（PCV-2）ORF2基因的体外重组质粒，序列片段序列见附录A。

6.5阴性对照

伪狂犬病毒病毒阴性样品、猪细小病毒阴性样品和猪圆环病毒2型阴性样品。

6.6引物和探针序列

引物和探针序列见附录B。

7病料采集和处理

病料采集和处理，请遵照NY/T541《动物疫病实验室检验采样方法》有关规定进行操作。

8病毒总核酸的提取

见附录C。

9荧光PCR反应

9.1多重荧光PCR反应体系

多重荧光PCR反应体系配制见表1。

表1一步法多重荧光PCR反应体系（总体积20uL）

混合液组份体积（uL）终浓度（nM）

2×IQPowermixPCR缓冲液101×

引物混合物0.8400

2

PCV-2探针（FAM标记）0.4200

PRV探针（Cy5标记）0.4200

PPV探针（Hex标记）0.4200

病毒总核酸