标准菌株制备作业指导书.docx

标准储存菌株和工作菌株制备作业指导书

一、目的

保证菌种经过较长时间保藏后仍旧保持较强的生命力，不被其他杂菌污染，削减菌株突变或发生典型的特性变化，从而保证微生物学检验结果的准确牢靠。

二、方法依据

《食品安全国家标准 食品微生物学检验培育基和试剂的质量要求GB4789.28-2023》及《附录B标准储存菌株和工作菌株的制备》。

三、适用范围

适用于本中心检验菌种〔大肠埃希氏菌、产气肠杆菌〕的传代、储存及工作菌株制备。

四、名词解释

标准菌株〔F0〕:直接从官方菌种保藏机构获得。

标准储藏菌株〔F1):将标准菌株在试验室转接一代以后得到的一套完全一样的独立菌株。

储藏菌株〔F2〕：从标准储藏菌株转接一代获得的培育物。

工作菌株：由标准储藏菌株、储藏菌株或标准物质转接一代获得的菌株。

五、培育基和试剂

养分肉汤

养分琼脂

乳糖蛋白胨培育液

5.475%乙醇

5.5无菌水六、仪器设备

6.1生物安全柜

6.2生化培育箱〔37℃，44.5℃〕

6.3高压蒸汽灭菌器

6.4冰箱〔4℃，﹣20℃〕

微型旋涡混合仪

水浴恒温振荡器

接种环

酒精灯

七、标准储存菌株的制备

本中心所需标准菌株从认可的菌种中心购置，并要求生产商供给验证报告。冷冻枯燥菌种为0代。本中心应做好符合性检查并做好符合性检查并填写记录，做好文件归档。

菌种复活

将标准菌株及已灭菌的培育基等用物移入生物安全柜。

点燃酒精灯，在酒精灯火焰四周5厘米无菌区内，用砂轮在距菌种管封口端1/3处划痕，75%酒精棉球消毒菌种管外壁，用无菌纱布包裹菌种管末端用力掰开。

用无菌吸管吸取0.5ml适宜的液体培育基加到菌快上，混匀

成菌悬液。再将全部菌悬液移入含有5ml适宜的培育基的培育试管中，在37℃生化培育箱中培育12～18小时。

取出培育试管，认真观看液体培育基是否浑浊，浑浊说明菌种复活成长。形成第一代菌种〔F1〕，各菌种适宜培育基及培育条件见表1.

在适宜的固体培育基上进展平板分别

选择适宜的鉴别平板，用灼烧灭菌的接种环完全浸入复活的培育基中，取一满环接种物，将接种环接触容器边缘3次去除多余的液体。划线时，接种环与琼脂平面的角度应为200～300。接种环压在琼脂外表的压力和划线速度前后全都，整个划线应快速连续。置于37℃生化培育箱中培育24小时。

菌种纯度检查和确认

观看菌落形态是否符合，同一平板上的单菌落的大小、外形、颜色、质地、光泽是否相像。对于消灭两种或两种以上形态的菌株，需要分别选择目标菌株。各菌种菌落形态特征见表1.

革兰氏染色

涂片：在载玻片上滴加一滴生理盐水，用灭菌接种环取典型菌落少许，与生理盐水混匀，涂布成薄膜。

枯燥：在室温中使自然枯燥。

固定：将载玻片快速通过火焰2～3次，以载玻片反面接触皮肤，热面不烫为度。

染色：滴加结晶紫染色液，染色1分钟，水洗

媒染：滴加革兰氏碘液，作用1分钟，水洗

脱色：滴加95%乙醇脱色，约30秒，马上用水冲净酒精

7.4.2.6复染：滴加复染液〔番红染液〕，复染1分钟，水洗显微镜下观看，革兰氏阳性菌染色后呈紫色，革兰氏阴性菌

染色后呈红色，见表1

表1菌种复活及鉴别

菌种特性

菌种特性

适宜培育基

鉴别平板

形态特征

革兰氏染色

大肠埃希氏

菌

养分肉汤

伊红美蓝平

板

呈紫黑色有金属光泽的菌落，

显微镜下为直链杆状杆菌

阳性

产气肠杆菌

养分肉汤

伊红美蓝平

板

呈现特别的红色黏液状形态

阴性

菌悬液的制备

挑取2-3个琼脂平板上的典型菌落，接种于盛有50ml的7.5%氯化钠肉汤〔养分肉汤〕的250ml锥形瓶中，于振荡频率30次/min的水浴恒温振荡器内36～37℃温度下培育12～18小时，可做为第2代菌种〔F2〕。

分装冻存

将80%无菌甘油与第2代菌种菌悬液按1:3～1:4分装至冻存管中，冻存菌种应制备多份，在﹣20℃条件下保存，有效期为3年。

菌种标识：应在保存菌种的容器外表粘贴标签，标签必需字迹清楚可见，应注明菌种的名称，标准号，传代次数，接种时

间，保存条件，有效期。一旦一代菌种制备成功，上一代菌种务必灭菌处理，处理过程应记录。

八、工作菌制备

取出﹣20℃保存的标准储藏菌株〔F2〕,溶化后分别在适宜的培育基平板上划线接种，置于37℃培育箱中，培育18～24小时分别培育出单菌落。

对单菌落进展形态学观看和革兰氏染色进展菌种验证〔见

7.4〕。

用适宜的培育基制备菌悬液〔见7.5〕。

制备300～3000个/ml工作菌株:先将已经制备好的菌悬液进展稀释。并对稀释后的菌悬液的浓度进展初步计数。稀释浓度以血球计数板在显微镜下每小格2～3个活动的菌为宜，此时的菌悬液浓度为8×