鸡球虫种类ITS1-PCR鉴定技术.pdfVIP

T/CVMAXXXXX—XXXX

鸡球虫种类ITS1-PCR鉴定技术

1范围

本文件规范了公认的7种鸡球虫种类ITS1-PCR鉴定技术。

本文件适用于鸡球虫病的临床诊断、防控监测、流行病学调查、疫苗生产及鸡球虫相关科研工作等。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682-2008,分析实验室用水规格和试验方法.

3术语与定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4符号与缩略词

下列符号和缩略语适用于本文件。

PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）

ITS：内转录间隔区（InternalTranscribedSpacer）

DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（Tris-acetate-EDTA）

bp：碱基对（Basepair）

5仪器设备和主要试剂

5.1仪器

PCR仪、4℃高速低温离心机、电泳槽，微量移液器、凝胶成像系统

5.2主要试剂

异硫氰酸胍、苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、70%酒精DNAMarkerDL-2000、2×TaqDNA聚合

3

酶Mix、琼脂糖、饱和食盐水（1000ml沸水中加入食盐380g，比重约1.18g/cm）

6操作步骤

6.1卵囊DNA的提取

取2000个左右待检鸡球虫孢子化卵囊置于2mL离心管中，加入直径为1mm的玻璃微珠0.2g,加入

600µL5mol/L异硫氰酸胍，涡旋振荡5min，显微镜下观察卵囊壁破碎情况，当大部分卵囊壁被破碎后，

2

T/CVMAXXXXX—XXXX

将其置于37℃水浴摇床上作用30min；加入等体积的饱和酚溶液600µL，振荡混匀20s,12000g离心5

min；将上清液转移至另外一个2mL离心管中，向离心管中加入等量的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：

1）的混合溶液，振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液；向上清液中再加入等量的氯仿：异戊醇

（24:1），振荡混匀20s,12000g离心5min，取上清液；最后加入两倍体积预冷的无水乙醇，上下颠

倒混匀，12000g离心10min，弃上清；向沉淀加入70%酒精，对DNA进行洗涤，并重复洗涤过程，弃

上清；室温干燥后，加入50µL双蒸水溶解沉淀，即得DNA模板，测定核酸浓度后-20℃贮存备用。

鸡球虫的阳性对照样品和阴性对照样品与待检样品同步、相同方法处理，进行DNA抽提。另外，

DNA提取也可采用市售的商品化DNA抽提试剂盒进行。

6.2ITS1-PCR检测

以提取的球虫基因组DNA为模板，按照附录A表1所示的7种球虫ITS1特异性引物和对应退火温度，

进行PCR反应。反应体系如下：2×TaqDNA聚合酶Mix12.5µL，上、下游引物50pmol∙µL-1各0.5µL，提

取的DNA模板2.5µL（0.5ng-0.5µg），添加双蒸水至25µL。PCR反应程序为94℃预变性3min；循环

反应：94℃45s，相应的退火温度（附录A表1）45s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸10min。

每次试验均需设立阴性对照、阳性对照。

6.3琼脂糖凝胶电泳

用1×TAE缓冲液配制1.2%琼脂糖凝胶，取10µLPCR反应产物与1µL的上样缓冲液混合均匀，用

微量移液器将产物加入到琼脂糖凝胶的加样孔中，同时加入Marker、阴性对照和阳性对照，进行琼脂糖

凝胶电泳，电泳程序为恒压120V，时间30min，电泳结束后将凝胶置于凝胶成像系统下成像，观察结

果并保存图片。

7结果判定

7.1阳性对照出现附录A表1