干细胞研究进展 PPT.ppt

ClinicalApplicationofSC干细胞应用(干细胞工程)StemBloodCells

造血干细胞移植在近30年里迅速发展壮大，为白血病、再障、先天免疫缺陷病等提供了崭新的、卓越有效的治疗方法。*脐带血的干细胞自我繁殖能力最强，繁殖速度最快，骨髓细胞次之。脐带血中干细胞比率最大，骨髓细胞次之。*1、细胞悬液的制备将干细胞所在的动物组织材料制备成单细胞悬液。组织的提取确定所需要的干细胞在机体中存在的部位，并取得这个部位的组织，这样即可获得目的干细胞同时又可达到初步富集的作用。干细胞体外培养技术

*细胞悬液的制备吸管、针头吹打组织研磨器研磨不锈钢或尼龙网搓洗胰蛋白酶消化螯合剂处理不含Ca2+、Mg2+的缓冲溶液泡机械分离：酶法解离：*细胞分离指将组织材料分散制成细胞悬液后，从中获取目的细胞的过程。细胞纯化从原代培养成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型的细胞的过程。2.干细胞的分离纯化*主要是根据不同细胞所具有的各自特性来实现物理特性密度、体积、电荷等化学特性特异性表面标志和功能分离纯化的原理**液氮保藏法原理：细胞在-130℃下代谢作用停止。液氮的温度可达-196℃，可使细胞的代谢活动停止，化学作用消失。保护剂：防止细胞破裂甘油二甲基亚砜(DMSO)3、干细胞的冻存与复苏*冻存复苏方法冻存：细胞悬液+保护剂→缓降温1℃/min，至-25℃→再置-70℃～-80℃低温冰箱,过夜→-196℃液氮长期保存。复苏：直接取出冻存管（-196℃）→立即置37℃水浴→1～2min内融化→倒入含培养液离心管→洗涤去除保护剂→细胞转入培养瓶中培养。*干细胞的体外培养即将上述从机体的组织中分离纯化得到的单个干细胞，给予必要的生长条件，模拟动物体内生长环境，使其在体外继续生长和繁殖。4.干细胞的体外培养条件*（1）营养要求：氨基酸、碳水化合物、维生素及一些无机离子、生长因子等。（2）环境条件：温度：哺乳动物细胞适宜的体外培养温度为35～37℃，一般控制37±0.1℃。体外培养条件*渗透压：多数细胞有一定的耐受渗透压能力，可在培养基配制时加以控制。气相：需要有氧条件，氧分压维持略低于大气状态，此外，还需CO2。pH：各种细胞对pH要求不尽相同，多数细胞pH7.2～7.6间生长良好。环境无毒和无菌：对培养用的容器清洗和消毒，对培养基除菌及灭菌。以防止真菌、细菌及支原体的污染。*悬浮培养指细胞在培养皿中自由悬浮生长的过程。用于非贴壁依赖型细胞。贴壁培养必须黏附在固体介质表面上生长的细胞培养。固定化培养（微载体培养系统）即适用于贴壁依赖型细胞,又适用于非贴壁型依赖性细胞的包埋培养方式。体外培养类型*5-9周的内细胞群，多能干细胞体细胞核转移（SCNT）去核卵细胞+体细胞核?克隆?囊胚?分离内细胞群?多能干细胞除精子外的任何体细胞*体细胞核转移技术（SCNT）*Gearhart的工作1998年，Gearhart从终止妊娠的胎儿组织中分离出多能干细胞。从捐献者那儿获得了知情同意书后，Gearhart从原本要发育成睾丸或卵巢的胎儿部位取得多能干细胞。黄禹锡教授曾在2004年运用SCNT技术，率先用人类体细胞克隆出早期胚胎，并提取多能干细胞。韩国汉城大学黄禹锡2005年Science论文被撤销吊销干细胞研究执照PrideofKorea?ShameofKorea!胚胎干细胞的鉴别胚胎干细胞具有以下特点：(1)细胞表面碱性磷酸酶AP活性高(2)端粒酶活性高(3)细胞膜表面有特殊的标记分子(markers)：SSEA-3,SSEA-4,SSEA-1等(4)可诱导分化为各种成体干细胞stage-specificembryonicantigen,SSEAA.AlkalinephosphataseB.SSEA-1C.SSEA-3D.SSEA-4Limitation胚胎干细胞研究受到伦理学限制*2003年：美国众议院以绝大多数票通过禁止应用干细胞克隆人类法案*2009年，奥巴马签署命令取消胚胎干细胞研究限制SFDA:中国干细胞市场每年60亿美元全世界每年