western-blot实验报告_原创精品文档.pdfVIP

一、实验目的

1.掌握Western-blot实验原理及方法应用

2.巩固SDS电泳相关操作

3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术

二、实验原理

Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶

转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。

三、实验材料

试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、

10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，

显影液、定影液

器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、

保鲜膜、胶片、摇床等。

四、实验步骤

1、样品制备

取相应组织，加入135μl无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15秒一次，匀两

次，再加入15μl10%的SDS。95°C水浴5分钟。10000g离心30分钟，取上清。每管20μl

分装。组织与匀浆液的比例=1:5-1:10

2、清洗玻璃板

3、灌胶与上样

(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以

免漏胶)。

(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿

玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。(灌

胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样

胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。

(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等20min使胶充分凝固就可倒去胶上

层水并用吸水纸将水吸干。

(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶

然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要

使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后(20min)，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其

拔出。

(5)将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要

垫一块塑料板且有字的一面面向外。)

(6)加足够的电泳液后开始准备上样(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板)。用移液器贴壁吸取

样品，将样品吸出不要吸进气泡。将移液器插至加样孔中缓慢加入样品。

4、电泳

电泳时间一般4～5h，电压为80V，1h；也可用120V，1.5h。电泳至溴酚兰至浓缩胶下

3cm可终止电泳，进行转膜。

5、转膜

(1)转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的PVDF膜。切滤纸和膜时一

定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的PVDF膜用甲醇浸泡15s，再用镊子捏住

膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里。在托盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、

滤纸和浸过的膜。

(2)将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面

的气泡(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动)。在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在

一起在垫于垫子上)，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

(3)用尺子跑后的胶撬开，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃

板便开始松动，直到撬去玻板(撬时一定要小心，玻板很易裂)。除去小玻璃板后，将浓缩胶

轻轻刮去(浓缩胶影响操作)，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整

使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将PVDF膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不

可再移动)并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可

合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡(操作时要戴手套，实验室要开门

以使空气流通)。

(4)将夹子放入转膜槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产

热，将转移槽埋于冰水混合物中来降温。转膜(30V，12h)。

6、免疫反应

(1)将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。

封闭液为5%的脱脂牛奶，质量体积比，溶剂为TBS。

(2)将一抗用TBST稀释至适当浓度(在15ml离心管中)；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于

实验台面上，四角用水浸