分子生物学基因工程和核酸杂交专家讲座.pptx

医学分子生物学

钟连进

检验医学院/生命科学学院;4基因工程;4.1工具酶;1、限制性核酸内切酶;第一个字母取自产生该酶细菌属名，用大写；

第二、第三个字母是该细菌种名，用小写；

第四个字母代表株；

用罗马数字表示发觉先后次序。;作用ⅠⅡⅢ;限制酶能识别双链DNA特异4?8个碱基对，并在此序列内特异切割DNA。

限制酶功效：依据需要在特定位点上准确切割双链DNA分子。

回文结构（palindromestructure）：指双链DNA分子上按对称轴排列反向互补序列（常为限制酶所识别）。;5?——GAATTC——3?;粘性末端（stickyend）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生末端。;;;;同工异源酶（isoschizomers）：指起源不一样，但能识别和切割同一位点酶。;1）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ）是单一多肽链多功效酶，分子量为103kD，它含有3种酶活性：

①5?→3?DNA聚合酶活性

②3?→5?核酸外切酶活性

③5?→3?核酸外切酶活性;;补齐双链DNA3?末端，同时可使3?末端DNA标识上同位素。

cDNA克隆中，合成cDNA第二链。

DNA序列分析。;TaqDNA聚合酶（简称Taq酶）是一个耐热DNA聚合酶，分子量为65Kd，最正确作用温度是70~80℃，Taq酶含有5?→3?聚合酶活性和依赖于聚合作用5?→3?外切酶活性。

TaqDNA聚合酶可用于DNA测序及经过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子特定序列进行体外扩增。;逆转录酶（reversetranscriptase）是依赖RNADNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功效酶。

①RNA指导DNA聚合酶活性（RDDP）

②核糖核酸酶H活性（RNaseH）

③DNA聚合酶活性（DDDP）;5?;末端脱氧核苷酰转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，简称末端转移酶）：分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子3?末端-OH上。

末端转移酶功效主要有：

在载体或目标基因3?末端加上互补同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。

用于DNA3?末端同位素探针标识。;(A、G、C、T)n;DNA连接酶（DNAligase）：称??基因工程缝纫针，它主要功效是催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子5?磷酸基团与3?羟基形成磷酸二酯键，将含有相同粘性末端或平末端DNA连接起来。

DNA连接酶包含大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两种类型。;;碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上5?-磷酸基团。主要用途有：

除去DNA片段上5?磷酸以防本身连接。

在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标识前，从RNA或DNA上除去5?端磷酸。;5、T4多核苷酸激酶;核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中单链部分。其主要作用有：

除去粘性末端以产生平末端。

除去cDNA合成时形成发夹结构。

分析RNA茎环结构和DNA-RNA分子杂交情况。;4.2载体;1、克隆载体;能自我复制并具较高拷贝数。

分子量普通10Kb。

带有遗传筛选标识。

有适当限制酶酶切位点，便于外源DNA插入和筛选。

多克隆位点（multiplecloningsites，MCS）：载体上含有多个限制酶单一酶切位点。;1）质粒克隆载体;pBR322质粒克隆载体;复制起始点;pUC系列载体;pUC18载体;2）噬菌体克隆载体;野生型?噬菌体是线性双链DNA，全长约48.5Kb，其中60%（约30Kb）是溶菌生长所必需，中间40%区域为非必需，可被外源DNA片段代替而不影响?噬菌体生存。

?噬菌体5?末端含12核苷酸互补单链次序，是天然粘性末端，称为cos位点，?噬菌体感染宿主菌后，其粘端经过碱基配对而结合，形成环状DNA分子。;?噬菌体载体结构;?噬菌体载体特点;?噬菌体载体用途;M13噬菌体;M13噬菌体在细菌内复制模式图;粘粒(cosmid)是由质粒和?噬菌体cos位点构建而成。

粘粒载体组成：

质粒复制起始位点(Ori)。

携带抗药基因。

用于插入目标基因单一酶切位点。

?噬菌体cos位点。;粘粒载体特点;粘粒载体用途;2、表示载体;汇报基因（reportergene）;1）原核细胞表示载体