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大肠杆菌中人过氧化氢酶基因的克隆与表达

摘要：在大肠杆菌中利用基因重组技术获得高效表达的人过氧化氢酶

(catalase，CAT)，即利用pMAL-c2x构建了从人cDNA文库中获得的CAT编码

基因融合表达载体，并进行了表达。使融合表达获得可溶性蛋白，为后续重组酶

性质的研究和开发利用奠定了基础。

关键词：大肠杆菌；人过氧化氢酶基因；融合表达；表达

1过氧化氢酶的功能与来源

在生物体的新陈代谢中，细胞有氧呼吸所消耗的O2约10%被还原成H2O2，

而其很容易被细胞中各种还原剂还原成OH-和极毒的自由基OH·，它能氧化与它

接触的几乎所有细胞组分，引起衰老、癌变及其它病症。

但生物体有自己的保护机制，体内存在的过氧化氢酶(catalase，CAT)能有效

地催化细胞中产生的高浓度H2O2(2H2O2→O2+2H2O)，使H2O2不至于与细胞

有氧代谢中产生的超氧阴离子自由基O-2·进一步生成羟自由基OH·，从而防止自

由基对细胞的损伤[1]。

此外，CAT还具有一些其它的生理功能。它除了可调节体内H2O2水平外，

还可充当Hb和其它含巯基蛋白质的保护剂。主要与细胞内线粒体及过氧体结合，

同D-氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联，从而迅速分解细胞代谢中产生

的毒性物H2O2，起到解毒与保护巯基酶、膜蛋白等作用[2]。

商品化的过氧化氢酶主要来源于牛肝、微球菌和黑曲霉[3]，多应用于工业

生产[4]。而对医药和保健来说，人源的CAT应用价值更高。本研究利用基因重

组技术将人CAT基因分别构建了融合和非融合表达载体，在大肠杆菌中实现了

有生物活性的表达，为其开发利用奠定了基础。

2人过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

2.1材料

人cDNA文库（购自PROMEGA公司）；

菌种E.coliTB1、JM109，质粒pMAL-c2x、pBV221，抗MBP抗血清，Amylose

Resin（购自NEB公司）；

TaqDNA聚合酶，限制性内切酶XbaⅠ、PstⅠ、NcoⅠ，DNA回收试剂盒，

DL3000DNAMarker，pMD19-TVector（购自TaKaRa公司）；

FactorⅩa（购自BioLabs公司）；

二抗（羊抗兔），（购自北京百灵克生物公司）。

2.2方法

2.2.1CAT基因的获得

根据Genbank上登录的人CAT基因NM-001752，利用primer5软件在基因

全长范围设计最佳引物对，正向为：5’-CGCACGCTATGGCTGACAG-3’，反向

为：5’-TGATGAGCGGGTTACACGG-3’，以人cDNA文库为模板进行PCR。

扩增后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收，克隆至pMD19-TVector，由北

京华大基因研究中心测序。2.2.2CAT表达载体的构建

根据阅读框架设计两对带酶切位点的引物，并以上述经测序验证的阳性质粒

为模板进行PCR扩增。其中引物对1，正向为：5’

-GCTCTAGAATGGCTGACAGCCG-3’，反向为：5’

-AACTGCAGTCACAGATTTGCCTTC-3’，并分别带有XbaⅠ酶切位点、PstⅠ酶

切位点。用限制性内切酶XbaⅠ、PstⅠ双切质粒pMAL-c2X及引物对1的PCR

扩增产物，分别回收目的片段与线性化载体片段后，用T4DNA连接酶连接过夜，

构建融合表达载体pMAL-c2x-CAT并转化至E.coliTB1。

2.2.3CAT基因的诱导表达

将37℃振荡过夜的重组菌按1％量转接到含抗生素的LB液体培养基中，

20℃培养6h，加入IPTG至终浓度1mmol/L诱导12h。超声破菌后，上清液用

AmyloseResin进行亲和层析纯化，SDS