《食品微生物检测》课件——第十章 微生物分离纯化与菌种保藏技术.pptxVIP

第十章微生物分离纯化与菌种保藏技术;第十章微生物分离纯化与菌种保藏技术;第十章微生物分离纯化与菌种保藏技术;授课内容;微生物菌种的分离与纯化

为了研究某微生物的特性，或者要大量地培养和利用某微生物，需要从自然界混杂的微生物群中分离单一的菌种，这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物菌种的分离与纯化。;第一节微生物菌种的分离纯化与保存;同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落

;显微镜下的菌落;第一节微生物菌种的分离纯化与保存;出发菌株的确定;（一)菌株的筛选途径;（二)含微生物样品的富集培养;;例二：分离筛选产高温淀粉酶（65℃）细菌;（三)微生物的分离纯化技术;1、用固体培养基分离纯种;;;（2）平板划线法;分区划线法适用于浓度较大的样品;连续划线法适用于浓度较小的样品;（3）稀释摇管法;（3）稀释摇管法;2、用液体培养基分离纯种;培养物在液体培养基中进行高度顺序稀释，如果经稀释后的同一稀释度的大多数（95%以上）试管中没有微生物生长，有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。;3、单细胞（单孢子）分离;;;（1）利用选择培养基进行直接分离;含牛奶选择培养基目的菌生长平板;。;（3）二元培养物;微生物纯培养分离方法的比较;生化特性（免疫学特性）

生产性能测定

毒性试验

据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验;（五)菌株的保存;液氮超低温保藏法

保藏时间达2-15年

适用于各种微生物菌种的保藏;斜面低温保藏法

方法简单、便于操作

菌种易变异、退化及污染

保藏时间一般为1-6个月;真空冷冻干燥保藏法

将菌种在极低温度下快速冷冻，然后在低温下真空干燥、封装，隔绝空气，使菌体细胞结构成分保持原来状态，达到长期保藏的目的。

适用于各类微生物

时间长达10年以上;授课内容;菌种衰退（degeneration）：是指菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。;（一）菌种衰退的具体表现;第二节菌种的衰退和复壮;第二节???种的衰退和复壮;第二节菌种的衰退和复壮;1、控制传代次数

即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的机率;2、创造良好的培养条件

结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复突变细胞

基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失

培养营养缺陷型菌株时应保证适当的营养成分，尤其是生长因子

控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。;3、利用不易衰退的细胞移种传代

在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就不会发生这种现象

另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退，而改用子囊孢子移种则能避免衰退。;4、采用有效的菌种保藏方法

有效的菌种保藏方法是防止菌种衰退极其必要的措施。

在实践中，应当有针对性的选择菌种保藏的方法

例如，酿酒酵母，保持其优良发酵性能最有效的保藏方法是－70℃低温保藏，其次是4℃低温保藏，而冷冻干燥保藏法和液氮保藏法并不理想

短期保藏——一般斜面冰箱保藏法

长期保藏——砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法

对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏方法（长期/短期）。;6、讲究菌种选育技术

在菌种选育时，应尽量使用单核细胞或孢子，并采用较高剂量使单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力,避免表型延迟现象。同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌种的纯度。;第二节菌种的衰退和复壮;复壮措施方法

纯种分离法

寄主体内复壮法

淘汰法

遗传育种法;1、纯种分离法

通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。

“菌落纯”的水平——稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落。

“细胞纯”即“菌株纯”的水平——培养皿或凹玻片等作分离室的方法、显微操纵器的纯种分离法。;2、宿主体内复壮法

对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。

例如：

苏云金芽孢杆菌——感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。

根瘤菌属——回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。;3、淘汰法

将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温等）往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的

例如：有人曾将“5406”的分生孢子在低温