生物技术制药重点.pdfVIP

）是不断引进现代生物化学、分子生

物学、细胞生物学、微生物学和制剂学及现代基因工程等多学科先进技术而形成与发

展起来的实用制药技术。

基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：①上游阶段：主要是分离目的基因、

构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达

系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此

阶段的工作主要在实验室内完成。、

②下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实

验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反

应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备

技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。

基因工程药物制药的主要程序：⒈目的基因的克隆⒉构建重组体⒊DNA重组体

转入宿主菌⒋构建工程菌⒌工程菌发酵⒍表达产物的分离纯化⒎产品的检验等

反转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆

表达。

反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：RT-PCR是将以RNA为模板的cDNA合成同PCR

结合在一起，该法是mRNA经反转录合成cDNA第一链，在以随机引物、oligo(dT)或

基因特异性的引物（GSP）起始协助下，PCR扩增，特异性的合成目的cDNA链（目的

基因）。

化学合成法：较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。合成目的

基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA

双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用

连接酶连接成完整的基因。

基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程

进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生

物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计

的关键。

表达载体必须具备的条件（1）载体能够独立的复制；（2）具有灵活的克隆位点和方

便的筛选标记。并且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；

（3）具有很强的Promoter，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；（4）具有

Repressor，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；（5）具有很强的终

止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因。

）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便

转录后能顺利翻译。

：（1）外源基因的拷贝数（2）外源基因的表

达效率（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢负荷（5）工程菌的培养条件

真核基因在大肠杆菌中的表达方式：（）以融合蛋白的形式表达药物基因融合蛋白氨

基端是原核序列，羧基端是真核序列。优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；

易高效表达；但只能做抗原。一般不做人体注射用药。（2）以非融合蛋白的形式表达

药物基因天然完整蛋白：非融合蛋白是指在大肠杆菌中表达的蛋白以真核蛋白的

mRNA的AUG为起始在其氨基端不含任何细菌多肽序列缺点：易被蛋白酶破坏；N

端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。（3）分泌型表达蛋白药物基因产物可跨膜

分泌至胞周间隙外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下游优点：分泌表达，避免

降解。

乙酸产生的原因及防治方法：①碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于

菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌

体的生长。②适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用③分批培养中选择不同的碳源，连

续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减

少它的抑制作用。④加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。

“严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点ppGpp

的结果。ppGpp是一个重要的调控分子。它通过影响RNA链的延伸过程减少转录。

它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA