- 1、本文档共12页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
包涵体蛋白的纯化及复性争论专贴!
zbbnetwrote:
最近试验遇到了大麻烦,说出来大伙帮助想想法。
试验所用菌株为BL21,载体pMAL-p2X,与MBP融合表达,目的蛋白有三对二硫键。最初的设计思想是想通过MBP的信号肽实现可分泌表达,但试验觉察主要是包涵体表达。菌体超声裂开后12023rpm离心,所获得的沉淀不能很好的贴在离心管底,而是处于局部溶解状态,对沉淀再作如下处理:
1、2M尿素洗涤,pH8.5,12023rpm离心,获得的上清不是澄清透亮而是略显混浊,这
次的沉淀能够结实的贴在管底。
2、4M尿素洗涤,pH9.0,12023rpm离心,获得的上清不是澄清透亮而是略显混浊,这
次的沉淀为半溶状态的冻状物。
3、8M尿素溶解上述2中的沉淀,几乎不见不溶的颗粒,但溶液还是略显混浊。上述三溶液取样电泳,均见较多的目的蛋白。
对3中的溶液取样调pH至12溶液照旧混浊。
0.22um过滤,无法去除混浊物。
考虑到混浊物是多聚体,样品中参加1%SDS和0.2%β-Me,都无法改善。
做上述处理,主要考虑到混浊物是目的蛋白,由于目的蛋白设计了6HIS但不能成功的结合Ni柱。
主要想请教这样几个问题:
1、有没有那位战友也碰上我上述的问题,这种问题是如何解决的?
2、我所描述的包涵体的状态说明白什么问题?
3、对与蛋白溶液混浊有什么好的处理方法?暂不争论分泌表达的问题。
答复:
你的状况很正常,依据三次沉淀处理状况,应当可以确定你的蛋白在8M
Urea中是完全可以裂解的。并且该蛋白如假设作复性应当可溶性较佳。但依据我个人的阅历。假设MBP融合蛋白还是以包含体表达的话是很没有意思的,建议作单独表达,除非单独表达不行。否则即使完全复性,目的蛋白活性也大打折扣。另可优化表达条件,有可能可容表达的,不要放弃,你的破菌上清也可以跑胶看看有没有目的蛋白。
说明蛋白蔬水性不强。
3。有些蛋白裂解后有浑浊格外正常,尤其是MBP融合的,即使做到可容也会有白乎乎浑浊的现象,只要不影响使用就行,没必要在意。
各位高手:
我原来在25-27度表达出可溶性蛋白,现在23、25、27度均是包涵体。现在,急着纯化,用包涵体〔GST融合蛋白〕复性纯化可以吗?怎样做?怎样保持目的蛋白的活性?
恳请赐教,先感谢了!!!
jingluowrote:
透析液总体积的50%?是不是在透析完毕后往蛋白溶液里加甘油?
不,是直接加在透析液里面。wrote:
不,是直接加在透析液里面。
加这么多的甘油,我担忧对PH的调配会不会有影响?
lmj2023wrote:
各位高手:
我原来在25-27度表达出可溶性蛋白,现在23、25、27度均是包涵体。现在,急着纯化,用包涵体〔GST融合蛋白〕复性纯化可以吗?怎样做?怎样保持目的蛋白的活性?
恳请赐教,先感谢了!!!
你这个问题好难答复,牵涉的问题太多。
建议你还是找找缘由解决蛋白不行容表达的问题。
由于假设你真的要做复性,那首先必需将GST融合蛋白复性好了,该蛋白才能挂柱纯化,但即使如此也不能保证你的目的蛋白能复性好。何况一般状况下复性效率都很低,不超过30%
依据我的阅历,假设蛋白GST融合后还包含体表达就一点意义都没有。所以还是回去解决可容性的问题,这样比把大量时间花在复性上有意义的多。
jingluowrote:
加这么多的甘油,我担忧对PH的调配会不会有影响?
不要紧,加完甘油后再调PH值,没问题的,我们始终这么做,呵呵。wrote:
不要紧,加完甘油后再调PH值,没问题的,我们始终这么做,呵呵。
好的,我明天试试。
erwinchenwrote:
你这个问题好难答复,牵涉的问题太多。
建议你还是找找缘由解决蛋白不行容表达的问题。
由于假设你真的要做复性,那首先必需将GST融合蛋白复性好了,该蛋白才能挂柱纯化,但即使如此也不能保证你的目的蛋白能复性好。何况一般状况下复性效率都很低,不超过
30%
依据我的阅历,假设蛋白GST融合后还包含体表达就一点意义都没有。所以还是回去解决可容性的问题,这样比把大量时间花在复性上有意义的多。
感谢了,那我就连续找可容性表达的方法了!
请教大家
我用PQE载体构建的重组体转化了BL-21,已诱导出目的蛋白。打算用该蛋白建立ELISA
法检测人群中的抗体。
下面打算纯化目的蛋白,已经购置了申能博彩的BBSTNTAResin
依据说明书的变性条件下从包涵体中纯化HisTag蛋白质方法纯化蛋白。我的问题是依据我的试验目的,用该树脂纯化之后是否需要进展蛋白复性?复性的方法是否就是用不同浓度梯度的尿素进
文档评论(0)