生化技术原理：第五章 凝胶过滤.ppt

琼脂糖凝胶按其浓度分：Sepharose2B（2％浓度）、4B（4％）和6B（6％）。Sepharose6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B。琼脂糖凝胶在干燥状态下易破裂，一般存放在含防腐剂的水溶液中，避免剧烈的搅动。CL型交联琼脂糖：Sepharose与1,3-二溴异丙醇（1,3-dibromopropanol）在强碱性条件生成的。优点：其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，热稳定性与化学稳定性好可在广范围的pH溶液（pH3-14）中使用，用较强的碱溶液短时间处理，性能不会改变。缺点：在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生解聚。琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。三、聚丙烯酰胺凝胶商品名Bio-gel。是以甲叉双丙烯酰胺（双体）作为交联剂，以过硫酸胺为催化剂，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，将丙烯酰胺（单体）聚合而成的。当改变单体浓度时，就可得吸水率不同的产物，商品型号有Bio-gelP-2到P-300。一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形式出售，使用前必须溶胀。特点：不溶于水和普通有机溶剂；能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡；在pHl-10或短时间超过此pH值的溶液中较稳定；要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅速发生分解（高温条件）。缺点：对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，使用离子强度略高的洗脱液操作可以克服。四、SephacrylSephacryl由烷基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。属硬性凝胶，具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。Sephacryl吸水时，其珠状颗粒直径平均值为70um。通常是用于水相系统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。

特点：a.在所有的溶剂中不溶解，化学降解很少；b.可在pH2-11范围内使用，当pH低时，葡聚糖链将发生少许水解作用；在0.2mol/LNaOH溶液中（室温下）处理100小时，对其低流速和多孔性没有明显影响；c.清洁剂（如SDS）、6mol/L盐酸胍和8mol/L尿素溶液可作洗脱剂，高温（120℃）消毒（pH=7时）处理后，层析性质没明显变化。Sephacryl能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖（Proteoglycans）。也可用于大的病毒颗粒（直径300-400nm）的分离。层析时，用细颗粒凝胶分辨率高。

第二节基本原理凝胶过滤层析的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。它可以完全或部分排阻大分子化合物；而不能排阻小分子化合物，让其在筛孔中自由地扩散、渗透。凝胶层析柱排阻的化合物范围在0-100％之间。洗脱体积（Ve）包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。?Ve一般是介于Vo和Vt之间的。对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，故其洗脱体积Ve＝Vo对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积Ve＝Vt分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。凝胶过滤的原理凝胶层析柱洗脱曲线示意图Ⅰ完全排阻的大分子Ⅱ中等分子Ⅲ完全渗透的小分子分配系数：表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关。Vo和Vt可以通过测定得到，测定了某个组分的Ve就可以得到这个组分的分配系数。在一定的条件下，Vt和Vo都是恒定值。大分子先从柱中流出→Ve值小→Kav值小小分子后从柱中流出→Ve值大→Kav值大Kav＝Ve－VoVt－Vo对于完全排阻的大分子Ve＝Vo故Kav＝0对于完全渗透的小分子Ve＝Vt故Kav＝1Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的Kav与其分子质量的对数成线性关系：Kav＝－blgMr+c由于Ve和Kav也成线性关系所以同样有：Ve＝－blgMr+c通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve或Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同条件下测定未知样品的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子质量。蛋白