药物靶标发现与确证举例.pptxVIP

IdentificationofhNopp140asabindingpartnerfordoxorubicinwithaphagedisplaycloningmethod.;阿霉素是一种广泛使用的抗癌药物。假设通过抑制DNA复制或转录行动，虽然其准确的目标和细胞毒性的机制仍然没有得到解决。表达人肝细胞cDNA一个T7噬菌体文库中筛选对固定阿霉素孤立阿霉素结合蛋白。选定的噬菌体含有核仁磷酸蛋白Nopp140，在核仁的生物合成的一个重要因素的C-末端区域。当所克隆的序列在大肠杆菌中表达时，重组蛋白磷酸化酪蛋白激酶II和低聚在镁离子和氟离子的存在下，如发生在体内。阿霉素结合到表达的蛋白为4.5×10-6M的解离常数，并且这种相互作用被抑制Nopp140的磷酸化。这些结果表明，阿霉素可能会破坏hNopp140的细胞功能。;药品名称阿霉素

别????名14-羟基柔红霉素，阿得里亚霉素，多柔比星

外文名称Doxorubicin

主要适用症适用于急性白血病，恶性淋巴瘤、乳腺癌等

用法用量40mg～60mg/m2，3周1次。

药品类型抗肿瘤药-细胞毒类药物;通过生物淘选阿霉素特异的噬菌体扩增

甲T7噬菌体文库展示人类肝细胞cDNA中筛选蛋白质特异性结合的生物素化的多柔比星（图1）上的链霉亲和涂层板。洗脱解决方案的噬菌体滴度从103PFU/ml的第一轮105PFU/ml的第四轮的结合和洗脱（图2A）后增加。以确认特定的噬菌体颗粒的富集，插入到洗脱的噬菌体的cDNA通过PCR用引物侧翼的T7噬菌体DNA的文库施工现场进行分析。从第一轮洗脱的噬菌体扩增产物出现作为涂片带（图2B，泳道1）。从第二，第三和第四轮扩增洗脱的噬菌体的PCR产物（图2B，泳道2,3和4），然而，发现在600和870bp的条带。这些结果表明，阿霉素特异性噬菌体的生物淘选程序选择性地扩增。;原理简介

噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。;阿霉素和硫氧还hNopp140C之间的结合直接测量

阿霉素和硫氧还hNopp140C之间的相互作用是通过荧光光谱法和表面等离子体共振分析分析。阿霉素具有530-600纳米的发光光谱与在555nm处具有峰值。加入以剂量依赖的方式重组的Trx-hNopp140C蛋白显著增加的发光强度，虽然频谱的形状几乎没有变化（图5）。BSA或硫氧还蛋白，然而，对荧光光谱没有影响（数据未显示）。有趣的是，磷酸化的Trx-hNopp140C也对阿霉素的荧光光谱没有影响，这表明多柔比星可以仅与脱磷酸化hNopp140C交互。;当Trx-hNopp140C施加到固定的阿霉素的CM5表面等离子体共振传感器芯片上，具有强大的结合曲线被观察到（图6）。Trx-hNopp140C结合的阿霉素的表观解离常数（Kd）计算为4.5×10-6M。正如在荧光测定试验，硫氧还hNopp140C的磷酸化形式未能结合阿霉素。当650bp的DNA片段（100纳米）施加到芯片表面，没有显著吸附曲线进行了观察。这些结果意味着，阿霉素特异性结合hNopp140的非磷酸化形式，具有比用于DNA更高的结合亲和力。;参考文献