生物学荧光定量PCR技术适用版.pptx

定量PCR是如何工作的

荧光定量PCR是什么一种实时监控目的基因PCR扩增的技术

定量PCR是如何工作的?传统PCR 具有以下基本要素dsDNA模版,primers引物,dNTPs核苷酸,PCRbuffer缓冲液,TaqpolymeraseDNA聚合酶等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+TACGGAGCTGA

与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行:双链DNA模板变性引物与模板退火引物延伸??新的扩增片段定量PCR是如何工作的?理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍

在PCR混合液中含有荧光物质。定量PCR是如何工作的?

无论哪个型号，所有的荧光定量PCR仪都有三个共同的组成部分定量PCR是如何工作的?

PCRPCRLotsofPCRPCRproduct随着扩增的进行,荧光信号会随着PCR产物的增加而增加定量PCR是如何工作的?

Real-timePCR仪会记录每个循环经过每个滤光片的荧光信号变化定量PCR是如何工作的?Cycle1FilterASample1Level:

为什么要用定量PCR？重复性好灵敏度高动力学范围宽一个好的定量PCR数据

PCR的动力学曲线和四个阶段

1:重复性好

2:灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因

3:动态范围宽兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围(越大越好)

指数扩增期重复性准确性动态范围3个阶段中最佳时期

只有一个扩增期提供高质量的数据指数扩增期

为什么要用定量PCR？快：节省时间和劳力（不用电泳检测）。

为什么要用定量PCR？安全：不用EB或放射性物质

定量PCR的化学原理

支持的化学试剂SYBR?GreenITaqMan?

TaqMan?中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物TaqMan?化学原理

第三段短片段序列，又称为探针,位于序列中间TaqMan?化学原理

报告染料Reporterdye淬灭染料Quencherdye探针标记两种染料分子TaqMan?化学原理

Reporter没有荧光信号（发射）能量光(激发)完整的探针TaqMan?化学原理

光能然而，如果探针断裂了……TaqMan?化学原理

Denaturation变性(95oC)TaqMan?化学原理

Annealing退火(60oC)TaqMan?化学原理

Taq酶登场……TaqMan?化学原理

找到引物序列……TaqMan?化学原理

开始延伸(60oC)TaqMan?化学原理

Extension延伸(60oC)TaqMan?化学原理

Extension延伸(60oC)TaqMan?化学原理

?Extension延伸(60oC)TaqMan?化学原理

Taq酶很特别……具有核酸外切酶活性，可以‘吃掉’结合到模板上的DNA片段TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

Taq酶降解探针TaqMan?化学原理

TaqMan?化学原理

TaqMan?化学原理

TaqMan?化学原理

TaqMan?化学原理

嗝!TaqMan?化学原理

TaqMan?化学原理每个循环后...理论上，反应管中目的基因的数量增加一倍；报告荧光的信号按照相应的比例增加；荧光信号的增加可以在扩增曲线图上看到。

SYBR?GreenI化学原理

SYBR?GreenI染料

SYBR?GreenI染料

SYBR?GreenI染料

SYBR?GreenI染料的缺点非特异结合任意双链DNA定量结果不准确非特异性PCR产物信号

使用熔解曲线Meltcurve(DissociationCurve)检查