畜禽产品中三类致病菌(单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌)梯型熔解温度等温扩增技术规范.pdfVIP

畜禽产品中三类致病菌(单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、产气

荚膜梭菌)梯型熔解温度等温扩增技术规范

1范围

本文件规定了畜禽产品中三类致病菌单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）、沙门

氏菌（Salmonella）和产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）的梯型熔解温度等温扩增检测方法

和操作规范。

本文件适用于畜禽产品中上述三类致病菌的核酸定性检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4生物安全措施

工作人员应具备微生物相关资质，所有使用过的培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。

5原理

选择Tm值曲线为梯型（包括人字梯型、半人字梯型和直梯型）的特异性核酸片段为靶序列设计巢式

引物，将巢式引物的外引物与内引物分别连接成一对引物作为等温扩增用引物，借助外引物与核酸靶序

列上对应片段的熔解温度差异提供单链模板，在DNA聚合酶（大片段）催化下通过合成反应与链替代反

应对梯型Tm值曲线的靶标核酸片段进行等温扩增，进行不同致病菌的定性分析技术。

6试剂和材料

6.1DNA提取试剂盒。

6.2实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。

6.3Tris-HCl；乙二胺四乙酸（EDTA）；异硫氰酸胍；TritonX-100；异丙醇；TE溶液（pH8.0）；

氯仿；异戊醇；TaqDNA聚合酶；BstDNAPolymerase；甜菜碱（Betaine）；dNTPs；MgSO4；BstDNAPolymerase

Buffer；SYBRGreenⅠ。

6.4致病菌特异性引物：根据单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌特异性核苷酸序列

（参见附录Ａ）设计的内、外引物及环状引物。

6.4.1单核细胞增生李斯特氏菌

Lm-FIP:5’-TGATGTTGGTGTTGCGTTTTGGGCA-

ATTAACAGGCGATAACT-3’

Lm-BIP:5’-CAGGAGGCGGCGGTTTTTCCAGTTG-

TCCCTTCTCCACC-3’

1

Lm-LF:5’-CGATTTCTTGTTTAATGA-3’

6.4.2沙门氏菌

Sa-FIP:5’-CCGGCCTTCAAATCGGCAT-

CAAGCCCGATTTTCTCTGGATGG-3’

Sa-BIP:5’-GAACGGCGAAGCGTACTGGAC-

ATCGCACCGTCAAAGGAA-3’

Sa-LF:5’-GAACGTGTCGCGGAAGTC-3’

Sa-LB:5’-CGGCAATAGCGTCACCTT-3’

6.4.3产气荚膜梭菌

Cp-FIP:5’-AGGCGGTGGTGGTGGATTTTGAGCT-

GCTTCCATGAGAGCTAT-3’

Cp-BIP:5’-CCTCCGCCGCCACTTTTTCCACAACA-

GTTCTTTGTCGTG-3’

Cp-LF:5’-CTCCGCCACCACCGCCGG-3’

Cp-LB:5’-GAGGAGGATCTTCTTCAC-3’

7主要仪器和设备

7.1移液器:量程0.1μL～10μL;量程10μL～100μL;量程100μL～1000μL。

7.2等温荧光扩增仪。

7.3台式高速冷冻离心机：转速不低于10000g/min。

7.4生物安全柜。

7.5核酸含量分析仪。

8操作步骤

8.1样品制备

8.1.1DNA提取

新鲜肉类、肉干和奶粉等固态样品：打磨匀浆或研磨成粉,称取1 g,加200μLTE溶液（pH8.0），

混匀，加400μL裂解液[5 mol/L异硫氰酸胍，0.05 mol/LTris-HCl(pH6.4)，0.02mol/LEDTA(pH8.

0)，1.3%