(1.10)--植物基因转化方法概述.ppt

植物基因工程概论第一节植物基因工程的概念及意义第二节发展简史与主要研究内容第三节常用的工具酶第四节常用的载体第五节目的基因的获得第六节目的基因转化第七节转基因植株鉴定第八节应用及存在的问题第六节目的基因转化植物目的基因转化(transformation)就是以一定方式将外源的目的基因导入受体植物细胞，并使之整合进植物基因组中，且能正常表达和稳定地遗传后代。外源目的基因能否转化成功依赖于是否采用良好的转化系统。植物基因转化系统可分为三大类型：①以质粒DNA等为载体的载体转化系统②不用任何载体，采用物理化学等方法直接将外源基因导入受体细胞的直接转化系统③以植物自身的生殖系统种质细胞，如花粉粒或其它细胞等为媒体的种质细胞转化系统。它们共包括11种转化方法（见表4.5）。表4.5植物基因转化系统示意图转化系统名称载体转化原理转化方法受体细胞种质转化系统种质细胞生殖细胞分生细胞花粉粒卵细胞浸泡法花粉管通道法细胞直接转化系统化学原理物理原理PEG法、脂质体法激光法、超声波法、电泳法、电击法、微针注射法、基因枪法原生质体载体转化系统病毒农杆菌DNARNARi质粒Ti质粒叶盘法、原生质体共培养法（细胞接种法）、共感染法（整体接种法）各种受体三类植物基因转化系统在使用/不使用载体、转化原理、及受体（细胞）等方面均存在明显差异载体的宿主范围、转化率、及操作复杂程度等也不同其特点比较见表4.6。表4.6常用植物基因转化方法特点比较评价条件植物基因转化方法农杆菌法PEG法电击法微针注射法基因枪法花粉管通道法受体材料细胞原生质体原生质体原生质体细胞卵细胞宿主范围有无无无无有性繁殖植物组织培养条件简单复杂复杂复杂简单无转基因植株转化率10-2~10-110-5~10-410-5~10-410-3~10-210-3~10-210-1~101出现嵌合体比例有无无无多无可操作性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵便宜转化效率高低低低高低单子叶植物的应用少可行可行可行广泛广泛从表4.6中可以看出：农杆菌质粒载体转化系统是双子叶植物最理想的转化系统，目前获得的转化成功事例中80%是采用此系统。其缺点是农杆菌对单子叶植物不敏感，特别是禾本科植物，从而在一定程度上限制了它的适用范围。PEG法、电击法、微针注射法的优点是无宿主限制，可适用于各种植物，特别能用于单子叶植物。通过原生质体转化获得的再生植株无嵌合体发生，有利于生产实践的应用。但是，目前大多数植物的原生质体培养仍然比较困难，再生频率低，重复性差。单子叶植物的原生质体培养比双子叶植物更困难。微针注射法操作困难、工作效率低，有时受到植物生育期的限制，故在植物转化中使用得越来越少。基因枪法是近年来迅速发展起来的转化技术，它除了具有上述直接转化系统的特点外，克服了以原生质体为受体细胞的缺点，可适用于任何植物和材料。但是应该看到，该转化技术目前还不成熟，外源DNA整合的机理尚不清楚，整合的外源DNA结构变化复杂，拷贝数较多，遗传稳定性较差等问题，尚需进一步完善和深入研究。基因枪轰击转化愈伤组织，表达GUS基因（蓝色部分）植物基因转化系统的选择原则：1）对农杆菌敏感的植物应首先试用农杆菌转化系统，因为农杆菌转化是在理论上和技术上都比较成熟的转化系统，而且其转化率高，转化植株的遗传稳定性最好；2）原生质体培养容易的植物应该采用直接转化系统，因为其优点是既能获得高的转化率，又能克服转基因植株嵌合体的难题；3）多胚珠植物可试用花粉管导入法，因为涂抹在柱头上的的外源DNA可以随着许多花粉进入子房，分别导入卵细胞中，提高转化率；4）子房中有较大单胚珠的植物，如核果类植物，可试用微针注射法，因为将外源基因直接注入卵细胞的可能性较大；5）对农杆菌不敏感、原生质体培养又困难等转化难度大的植物，可采用基因枪法；6）其它可根据供试外植体的特点选择相应的转化方法，如以植株为材料，则应采用注射法或花粉管导入法；以叶片为材料，则应采用农杆菌载体叶盘法或基因枪法；以原生质体为受体细胞则可