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实验一大肠杆菌基因组DNA的提取及电泳鉴定

一、琼脂糖凝胶电泳注意的问题：

1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度

的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。

长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。

2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景

的强度，应有选择地使用。

3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，

避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。

4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加

样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾

和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。

5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。

6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除

这种影响。

7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有

可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓

度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。

二、如果提取的DNA中含有蛋白质和RNA污染,应如何解决?

蛋白污染可以考虑用酚氯仿多抽提几次,记得吸上清的时候小心点,宁可浪费也别吸到界面.

一般后续还需要用氯仿/异戊醇抽提来去除酚.这样基本蛋白污染就可以去干净.实在不行,抽

提一次后,就用蛋白酶K消化30min,再抽提.

如果DNA多,RNA污染就添加RNaseA消化,你可以中途取少量跑胶检测,RNA去干净了再

抽提,再沉淀DNA.

三、如果提取的DNA产量较低，分析原因并提出解决办法。

1）样本材料老化或反复动容导致DNA含量下降。

解决：应选择新鲜的材料样品，不能及时处理的样品应立即放入液氮或-70℃低温保存，以

避免DNA降解。

2）样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放。

解决：动植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G+细菌就、酵母等破壁较困难的样品应用溶

菌酶、Lyticase酶或机械协助破壁。

3）样品过多导致细胞裂解不充分

解决：不同来源样品根据查阅资料，加量不同。

4）DNA吸附不充分

解决：如在上吸附柱前未加入无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA不能

充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此在样品裂解后加适量无水乙醇，在加上吸附柱使DNA

与硅胶模充分吸附。

5）DNA洗脱不当

解决：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶模上洗脱下来，应确保洗脱液pH在7.0~8.5

之间。

实验二PCR扩增大肠杆菌甘露-1-磷酸脱氢酶基因及PCR产物的纯

化

一、简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg离子、dNTP、引物DNA、

缓冲液、TaqDNA聚合酶）

二、如果检测结果中出现了很多非特异性条带，可能有哪些原因？

①引物特异性不强；②Mg2+浓度过高；③引物二聚体形成；④退火温度过低；⑤循环次

数过多

三、PCR过程中预变性3min，最后保温10min的目的分别为

3min是为了使母链被充分打开，10min是为了充分延伸

实验三碱性裂解法提取表达质粒载体PET-28a及电泳鉴定

一、质粒的基本性质有哪些

1,环状DNA分子能够自我复制,或整合到染色体上,随染色体复制.(最重要一点,可复制)

2,有多个限制酶切点(便于切割)

3,有标记基因(便于进行检验)

二、碱裂解细胞抽提质粒的基本原理是什么？

三、操作时应注意的问题

1、溶液一、溶液三冰浴效果好

2、溶液二现用现配

3、溶液三加入后,注意复性时间,太长太短都不行.

4、转管吸取上清液时,不要带入蛋白沉淀,宁缺勿滥.

5、最后干燥时,时间也不宜过长.

6、提取过程应尽量保持低温.

7、提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚

或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提.

8、沉淀DNA通常使用冰乙醇,在