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PCR引物设计原则总结

PCR引物设计的目的是为了找到一对适宜的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应推测将要扩增的片段单链是否形成二级构造。如这个区域单链能形成二级构造，就要避开它。如这一段不能形成二级构造，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重查找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。

引物确定以后，可以对引物进展必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端确定不能进展任何修饰，由于引物的延长是从3′端开头的。这里还需提示的是3′端不要终止于密码子的第3位，由于密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：

①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级构造。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不行修饰。

⑩引物3′端要避开密码子的第3位。

PCR引物设计的目的是找到一对适宜的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不行能有一种包罗万象的规章确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

避开产物的二级构造区

某些引物无效的主要缘由是引物重复区DNA二级构造的影响，选择扩增片段时最好避开二级构造区域。用有关计算机软件可以推测估量mRNA的稳定二级构造，有助于选择模板。试验说明，待扩区域自由能〔△G°〕小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。假设不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2〔G+C〕+〔A+T+，Ln值不能大于38，由于38时，最适延长温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度〔74℃),不能保证产物的特异性。

G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在肯定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。假设按公式Tm=4〔G+C〕+2

〔A+T〕估量引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最正确。

碱根底随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

引物自身

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状构造牙引物本身复性。这种二级构造会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。假设用人工推断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

引物之间

两引物之间不应不互补性，尤应避开3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

引物的3′端

引物的延长是从3′端开头的，不能进展任何修饰。3′端也不能有形成任何二级构造可能，除在特别的PCR〔AS-PCR〕反响中，引物3′端不能发生错配。

在标准PCR反响体系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP〔四种dNTP各200μmol/L〕以质粒〔103拷贝〕为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有肯定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。

引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

密码子的简并

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子