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PCR过程问题全解
如何防止PCR形成引物二聚体?
在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,比照marker时都不简洁看出其大小,具体是什么缘由呢?PCR时模板DNA浓度一般是多少最适宜?
答:1这条亮带假设在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了,形成引物二聚体的缘由很多,如引物设计的不好,在两端简洁形成回文构造或是两条引物之间也可能会互补配对;退火温度没有到达最正确,实在不行就做个温度梯度吧;再就是试着转变一下循环数,或许会有帮助。
PCR模板大约在104-106个拷贝。
答2:我觉得是目的条带含量太多了,假设点样太多,负载量太大,就会造成跑胶时条带太宽。可以试着削减模板量,稀释10倍或是削减循环数。
答3:1.从引物自身着手,重设计引物,这是最根本解决这一问题的方法;
可能模板有问题;PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致;
Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度;
取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后快速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再参加反响体系当中,引物二聚体就会消逝的;
所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增加特异性;
PCR反响体系的配制在冰上进展,最终加TAq酶,PCR完毕后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。
增加循环数可以适当降低引物二聚体;
降低退火温度后有条带,则应渐渐提高温度,假设提高温度的同时产物量削减,则考虑增加镁离子浓度〔依据扩增片断长度而定,片
段长则相应镁离子浓度应当高一些〕;
假设降低退火温度,觉察还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区分,则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。
以上次的pcr产物作模板二次pcr,可以提高引物与模板的特异性,削减引物二聚体,假设两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100-1000倍,假设间隔较长可以稀释50-100倍。
PCR假阴性的缘由分析
PCR的假阳性问题是在PCR诞生之初就被深刻生疏到了,同时由于造成假阳性的因素相
对单一,因此假阳性并不是困惑检验工作的主要缘由。假设一个工程只是阳性率高敏感性好的话,那么可以认为其阴性结果具备很高的可排解性,仍旧有相当的临床适用价值。但PCR的假阴性在检验工作中仍很严峻,并且用些因素常常被人无视,严峻的影响了PCR的使用。可以想象一种假阳性和假阴性都很高的工程,有什么样的诊断价值。造成PCR假阴性的缘由是简单的,也是多样的。主要有:
PCR仪本身的质量问题。PCR仪设计原理上的差异和常常消灭的质量问题〔如:温控不准等〕给临床带来了诸如非特异性扩增〔假阳性〕、扩增效率下降(假阴性〕等问题.
离心机问题。离心机的质量或使用不正确,造成离心标本模板没有分别出来造成假阴性,窃以为这是最易被无视的问题。其时离心机使用问题不仅在PCR,在整个检验工作中都是最易被无视的问题,只是由于在其他工作中不象PCR那样明显影响检测结果罢了。
离心机是常用的固液分别设备,其利用离心过程中的离心力而将密度不同的物质分别出来。因此离心机的关键在于离心加速度而不是转速,依据牛顿定律可知离心力加速度与转速和有效半径的有关的,因此对于不同有效半径的离心机一样的转速其离心加速度是不同的,转速的调整要因离心机而异,但很圆满,日常工作中无视了这个问题。有效半径短的离心加速度就小,同样的时间离心效果就差可能造成分离不出导致假阴性。同时由于高速离心机高速旋转与空气摩擦会产生
大量的热,因此对于称能上几万转/分而没有抽真空的离心机实际转速本人持疑心态度。
试剂开壳剂和操作问题造成标本DNA没有暴露出来,致使扩增无法进展,这是造成假阴性的又一主要因素。
问题1:无扩增产物
现象:正比照有条带,而样品则无缘由:
1.模板:含有抑制物,含量低2.Buffer对样品不适宜
引物设计不当或者发生降解
反响条件:退火温度太高,延长时间太短对策:
1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度
重设计引物〔避开链间二聚体和链内二级构造〕或者换一管引物
降低退火温度、延长延长时间
问题2:非特异性扩增现象:条带与估量的大小不全都或者非特异性扩增带缘由:
引物特异性差
模板或引物浓度过高
酶量过多
Mg2+浓度偏高
退火温度偏低
循环次数过多对策:
重设计引物或者使用巢式PCR
适当降低模板或引物浓度
适当削减酶量
降低镁离子浓度
适当提高退火温度或使用二阶段温度法
削减循环次数
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