PCR体系优化新课件.ppt

荧光PCR体系的优化及多色荧光PCR程扬健厦门大学生命科学院分子诊断实验室1.

认识它们吗？！2.

什么是Ct值和ΔRn？Ct值中的C代表循环数（Cycle），t代表域值（threshold），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。ΔRn:相对荧光强度Ct(S/B)3.

为什么用Ct值定量而不用终点相对荧光强度定量4.

实时荧光PCR是如何定量？利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。在一定范围:Ct值∝1lgC5.

PCR检测过程样品处理PCR扩增结果检测RealtimePCR6.

实时荧光定量PCR优化目标1、Ct值2、ΔRn值3、R值7.

优化内容引物设计和筛选探针设计和筛选反应体系的优化反应程序的优化HCV分子信标8.

引物的设计与筛选1序列查找与比对9.

附：主要数据库的网址数据库组织网址MEDLINENationalLibraryofMGenBankNationalCenterforBiotechnologyIEMBLEuropeanBioinformaticsInstitutewww.ebi.ac.ukDDBJNationalInstituteofGenetics,Japanwww.ddbj.nig.ac.jpSWISS-PROTSwissInstitutesofBioinformaticswww.expasy.chPIRNationalBiomedicalResearchFPRFProteinResearchFoundation,Japanwww.prf.or.jpPDBResearchcollaboratoryforStructuralCSDCambridgeCrystallographicDataCenterwww.ccdc.cam.ac.uk10.

二级结构分析条件：42℃；50mMNa+;2.5mMMg2+/~zukerm/rna/引物的设计与筛选211.

HCV5’UTR引物设计5’3’HCV引物的设计与筛选312.

引物筛选结果12345引物的设计与筛选413.

引物用量的优化不对称PCR（S/A=1：4）Vs对称PCR（S/A=1：1）引物的设计与筛选514.

探针设计和筛选1探针设计15.

探针设计和筛选2探针的Tm值16.

＋探针设计和筛选3退火温度的确定17.

探针用量的优化0.6uM0.3uM0.15uM探针设计和筛选418.

不同TaqE的比较Taq1Taq2反应体系的优化119.

TaqE浓度的优化0.5U/T1.0U/T2.0U/T3.0U/T反应体系的优化220.

dNTP浓度的优化20uM/T10uM/T40uM/T80uM/T反应体系的优化321.

Mg2+对荧光强度的影响22.

Mg2+和退火温度的优化

--------(方阵法）

23.

PCR促进剂的影响24.

AMV与M-MLV的比较M-MLVAMV25.

M-MLV的用量的优化WellCtF1 27.373F2 30.291F5 26.144F6 29.143G1 26.205G2 29.896G5 26.221G6 29.661H2 26.279H3 29.854H4 0.00010u/test20u/test30u/test40u/test50u/testNTCF6F526.

高浓度RNA低浓度RNA比较了四个浓度：24U/T12U/T8U/T4U/TRNA酶抑制剂浓度的优化27.

成分作用优化前浓度优化后浓度上游引物DNA正链扩增引物0.15uM0.15uM下游引物RNA逆转录和DNA负链扩增引物0.15uM0.6uM探针与模板杂交，发送信号0.15uM0.6uMTaq酶合成双链DNA1.2U/T2U/TdNTP为模板复制提供原料20uM/T20uM/T镁离子支持Taq酶活性1.5mmol2.5mmol逆转录酶将RNA逆转录成cDNA30U/T20U/TRNA酶抑制剂防止RNA降解12U/T12U/T扩增缓冲液提供稳定的反应环境pH8.6pH8.6优化前后含量对比28.

逆转录时间的比较逆转录时间（30min；45min；60min）45min反应程序的优化29.

RT-PCR扩增程序优化RT-PCR扩增程序（优化前）42度，60分钟95度，3分钟95度，30秒55度，20秒逆转录