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实验十六氨基移换反应的定性鉴定及氨基酸的纸层析

实验十六氨基移换反应的定性鉴定及氨基酸的纸层析

实验类型：验证型

目的和要求

1．学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理。

2．进一步掌握纸层析的原理和操作技术。

3．了解氨基移换作用在中间代谢中的意义。

原理

氨基移换酶也称转氨酶。它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮基的α-酮基互

换，这种作用称为氨基移换作用。它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢

中，在糖、脂肪、蛋白

质三类物质代谢的相互联系、相互转化上，都起着很重要的作用。转氨酶的种

类甚多，任何

一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的最适PH接近

7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸-草酸乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及谷

氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT）活力最强。

上述两种酶均广泛存在于生物机体中。在正常人血清中也有少量存在。机体发

生肝炎、

心肌梗塞等病变时，血清中转氨酶活力常显著增加，在临床上转氨酶活性的测

定有重要意义。

测定转氨酶活性的方法很多，如分光光度法、纸上层析法及光电比色法等。

本实验利用纸上层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成

的丙氨

酸，证明组织内氨基移换作用。为了防止丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还

原，可加碘乙酸

或溴乙酸以抑制酵解作用或氧化作用。

氨基酸的纸上层析属于分配层析。以滤纸及其结合水作为固定相，把欲分离的

混合氨

基酸样品加于滤纸上，使流动相（展开剂）经此移动，样品中各组分就在两相

溶剂问发生分

配现象，在固定相中分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度就慢；在流

动相中分配比

例较大的氨基酸，随流动相移动的速度就快。由于各种氨基酸的分配系数不

同，就逐渐集中

于滤纸上不同的部位，而彼此分离。层析完毕后，可用茚三酮乙醇液喷洒滤

纸，使氨基酸显

色形成斑点。组分的比移值（Rf）表示如下：

，，点样原点中心到层析点中心距离rRf,，，点样原点中心到溶剂前沿距离

R

各种氨基酸都有其特征的Rf值，因此可根据Rf值来鉴定被分离的氨基酸。

操作方法

一、酶液的制备

将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。用表面皿称取1.5克肝

脏，放入匀浆器中，再加入3毫升磷酸缓冲液。研成匀浆后，倒入离心管中，在

2500转／分的条件下，离心5分钟，取上清液，即为制备的酶液。

二、体外氨基移换反应

取2支试管，编号。向1号试营中加入15%三氯醋酸溶液10滴和酶液10滴，

混匀，静置15分钟，做对照管。向2号试管中加入酶液10滴，然后向1、2号试

管各备加入10%谷氨酸溶液10滴、1%丙酮酸溶液10滴、0.1%碳酸氢钾溶液10滴

和0.05%碘乙酸溶液5滴，混匀，放入37?一40?恒温水浴中保温1.5—2小时。在

保温过程中，将试管摇荡几次。保

温完毕后取出试管，立即向第2号试管中加入15%三氯醋酸溶液10滴以沉淀蛋

白质终止酶反应。将2支试管的内容物分别离心，2500转／分，5分钟。将上清液

转移到试管中，用塞

塞紧，放置于低温处备用。

二、纸上层析法检查

取4根毛细管，再取10cm×15cm层析滤纸1张。分别将对照上清液（1号

管）、样品上清液（2号管），标准谷氨酸溶液和标准丙氨酸溶液点在层析滤纸的

基线上。点样时，将毛

细管口轻轻触到滤纸上，使每种溶液分别形成直径为2—3毫米的圆斑，两点

间隔约1.5cm。为了有足够量样品点在滤纸上，每种溶液应重复点3—4次。待自

然风干（或用吹风机吹干），

再点下一。点样量应力求均匀相等。

在洁净干燥的小培养皿中，加入约20毫升酚溶剂（展开剂）。将小培养皿放

在层析缸

底部，加盖密闭，保持10分钟，使缸中展开剂蒸气达到饱和。将滤纸点样端

朝下悬挂于层

析缸盖中心的挂钩上，放入层析缸，使点样端浸入展开剂中约0.5cm，不要使

点样点直接与溶剂接触，加盖密闭，进行层析。待展开剂上升至滤纸上端2cm处时

（约需1小时），取出滤纸，用铅笔划上溶剂前沿，室温干燥或吹干。用玻璃喷雾

器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮无