实验室常用几种细胞实验的实验步骤和细胞荧光染色方法小结专家讲座.pptx

几个细胞试验步骤;人脐带纵剖面和直观图;试验操作步骤;打开NS.，点燃酒精灯（不提议使用），将酒精棉铺开在操作台中央，方便将全部器械和瓶盖摆放。;

3将半月盘内倒入少许无菌NS.,取出新鲜脐带轻轻放入半月盘内，用灭菌后脱脂棉球将脐带外周血迹擦干，将脐带两端血迹擦干方便暴露静脉血管。将圆头不锈钢针头轻缓插入两端静脉血管内，并顺势用止血钳夹死固定。注意：本试验操作时要戴好橡胶手套，操作前进行医用酒精擦拭消毒，当脐带过短时，只要一端插入圆头针，另一端用止血钳夹死。

;实验室常用几种细胞实验的实验步骤和细胞荧光染色方法小结专家讲座;用无菌NS.,将脐带静脉血管内淤血冲洗洁净，直到冲出NS.无色为止，接着将血管内空气抽闲，两端固定。;实验室常用几种细胞实验的实验步骤和细胞荧光染色方法小结专家讲座;5将Ⅱ型胶原酶注入脐带静脉血管内，此步骤操作时，注意两端注射器要往返做活塞运动方便使血管内壁与Ⅱ型胶原酶充分接触，注入Ⅱ型胶原酶百分比为8ml/15cm。注意：普通本步消化时间为10分钟左右，Ⅱ型胶原酶温度确保在37℃左右消化能力最好。尤其提醒是在消化过程中要用手往返揉搓脐带外壁，有利于内皮细胞脱落，此细节至关主要，决定了试验成败

;实验室常用几种细胞实验的实验步骤和细胞荧光染色方法小结专家讲座;此细节至关主要;终止消化，将静脉内含有EC细胞消化液注入含有小牛血清离心液里终止消化，二者百分比为1:1，并用离心液冲洗静脉血管两次，并将搜集细胞悬液装入离心管，封口

离心，将离心管放入离心机，设定离心速度和时间。普通1200r/min,8分钟。

待离心机完全停稳后，打开，取出离心管。小心取放，防止震动幅度过大，倒去上清液，将贴壁细胞用新鲜培养基全液吹打垂悬，放入细胞培养瓶（普通5ml/瓶）

;937℃,5%，CO2孵箱培养，第二天换液，去除未贴壁细胞，继续培养。待细胞几乎铺满瓶底时传代约为3/4。;二SMC原代培养;SMC细胞起源;试验操作步骤;观察脐带纵面，找到脐带内两根动脉，从中间小心剪一豁口。用组织剪牵拉两部分，直至分离出动脉血管。

将剖离动脉转移到一洁净6孔板内,孔内加???少许NS.;剥离血管外膜，小心用一眼科直镊夹住血管一端，用另一把弯镊轻轻向下牵拉血管外壁，直到显著可见一层状组织与内层组织分离。此时应夹紧该层组织，快速向下剥离。

注意：此步骤最为关键，直接决定细胞组织增殖活力

7将剩下血管组织再次转移到另一孔内，孔内加入少许NS.,用弯镊夹住血管一端轻轻地套在眼科剪前端，渐次将组织依次剪开，用一灭菌脱脂棉轻轻擦拭血管内壁，除去血管内皮细胞;8将血管中层再次转移到一孔内,孔内加入少许培养基，用眼科剪（直）将组织尽数剪成1mm×1mm小组织块;将剪好组织块用一弯头吸管吸出来放进细胞培养瓶内，小心将培养基吸出来，将组织块轻轻地均匀贴在细胞瓶底。

加入新鲜培养基，小心不要将瓶底组织块冲刷掉。

将细胞培养瓶放入37℃,5%，CO2孵箱培养

注意：此时细胞培养瓶是倒置，第二天翻转培养瓶时才使得组织块浸入培养基里

12培养到第六天时可见组织块周围有细胞攀爬出来，今后两天便可进行首次传代;三MSC原代培养;培养方法;将老鼠引颈处死，放入事先配好医用酒精内浸泡15分钟后，转移到超净室内。

用大号止血钳夹住鼠尾，用无菌NS.将大鼠身上酒精冲洗洁净后，放入无菌半月盘内，转移至超净台内。剪去鼠尾。

用第一套器械，小心剥离老鼠四肢表皮，露出肌肉层。

用第二套器械，小心剥离老鼠四肢上肌肉层，露出股骨和胫骨;用第三套器械，小心剥离老鼠胫骨和股骨

注意：此步骤很关键，在分离四肢股骨、胫骨时要格外小心，最好用眼科剪，不可暴露骨髓腔

将股骨和胫骨转移到小培养皿内，里面倒入少许NS.，用眼科剪和眼科镊将骨头周围肌肉组织剥离

将剥离后股骨和胫骨转移到一新培养皿内，小心并快速用大号组织剪剪断骨头两端，暴露骨髓腔。

不提议使用酒精，此步骤以前各步在确保无菌操作情况下可防止染菌;将剪断骨髓，用5ml注射器吸收无血清培养基重复冲洗骨髓腔。搜集骨髓悬液培养基。

在50ml离心管内加入Ficoll人淋巴细胞分离液，将细胞悬液小心铺在分离液上层

注意：在操作此步骤时，要戴好手套，口罩，在Ficoll液面上铺细胞时眼睛要与页面平齐

小心封口离心管，离心机内离心，设定为r/min,30分钟

离心后取出离心管，小心吸收离心管内中间白色云雾层，用无血清培养基混匀后再次离心，设定为1500r/min,10分钟;将离心后上清液弃除，用新鲜全培养基垂悬细胞，装入细胞培养瓶

15将细胞培养瓶放入37℃,5%，CO2孵箱培养

24小时后将细