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激光扫描共聚焦显微技术;激光扫描共焦显微镜的设计特点:
1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole
2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点,被探测点所在的平面为共焦平面
3.具有扫描系统——逐点扫描成像
4.激光作为光源
5.具有多种(四个)荧光通道,可同步探测多种被标识物;FluorescentMicroscope;;电子显微镜的缺陷:
1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难.
2.样品制备过程(固定、包埋、切片)导致的假象
荧光显微镜的缺陷:
1.无法实现对荧光,透射光的同步采集,无法实现多荧光的同步采集
2.荧光散射光太强,导致实际辨别率的大大下降。
3.荧光漂白很快,使荧光图像的拍照有困难。
4.无法对样品进行断层扫描,完毕3D的工作.
5.对于信号较弱的样本,无法提高观测的敏捷度.
6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内构造高度重叠;激光共聚焦显微镜的应用;时间辨别和迅速扫描动态图像;;Hela
green-中心体
red-纺锤体;二.光学切片和三维重组
光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能,可获得标本真正意义上的三维数据,经计算机图像处理及三维重建软件,产生生动逼真的三维效果,可进行形态学观测,并揭示亚细胞构造的空间关系,用以阐明三维构造与组织功能之间的关系。;显微CT与三维重组;3Dreconstruction;三.动态测量
游离Ca2+,Mg2+、K+、Na+测量
pH值的检测
;相对测量
程序化测量:用timelapse中的编程按钮可进行不一样步间
序列的扫描测量
?F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)
;;FRAP(Fluorescencerecoveryafterphotobleaching)原理;荧光光漂白后的答复:FRAP
生物膜脂质分子的侧向扩散;
胞间通讯的研究;
胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等
细胞骨架构成、核膜构造及大分子组装等。;;荧光共振能量转移(FRET)技术
生物大分子构造和功能研究
免疫分析
核酸杂交分析
蛋白质间互相作用研究
r:分子间距离
R0:分子间发生50%能量转移的距离;检测
以FL1的激发波长的光照射样品,没有共振转移时,只检
测到FL1的发射光(绿光),发生共振转移时,就可检测出
FL1的荧光(绿光)减弱,FL2(红光)的增强。
应用:检测大分子的互相作用
?大分子构象的变化(蛋白)
例:大分子(亚基)的结合与分离
?受体与配体的结合
?常用荧光探剂:FITC/TRITC,Cy3/Cy5,BFP/GFP ;曲霉营养菌丝横隔;植物学应用:
植物细胞中的微管列阵(microtubulearray);农业的应用:
植物细胞中的微丝分布;农业的应用:
花粉萌发过程中微丝骨架的变化;农业的应用:
Jasplakinolide解聚微丝的实时观测;;;;GFP-MAP4融合蛋白体现显示微管骨架(美国Cyr试验室);奶山羊发育中乳腺上皮细胞重要细胞器的变化;重要试剂及耗材
DMSO购自Sigma企业;
优质胎牛血清(FBS)、DF12培养基、I型胶原酶均购自Gibco企业;
内质网荧光探针(E-34251,激发/发射波长为504/511nm)、
线粒体荧光探针(M-7512,激发/发射波长为579/599nm)、
Hochest33258均购自Invitrogen企业。
Confocal专用细胞培养皿购自北京博蕾德科技企业。;乳腺上皮细胞重要细胞器的检测
37℃预热、终浓度为50nmol/L的M-7512工作液,37℃染色40min;
37℃预热、终浓度为1μmol/L的E-34251工作液,37℃染色30min
10μg/ml的Hochest33258复染5min
图像采集与数据处理
激光扫描共聚焦显微镜使用三通道(PMT)检测。
激发谱线:405nm(激发Hochest33258标识的蓝色荧光,染核
488nm(激发E-34251标识的绿色荧光,染内质网)
543nm(激发M-7512标识的红色荧光,染线粒体)。
扫描模式为xyz,以0.4μm的Z轴步距逐层扫描,点平均2次,面平均4次,三个通道序列扫描成像,overlay处理后采图保留。
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