激光扫描共聚焦显微镜课件.ppt

激光扫描共聚焦显微技术;激光扫描共焦显微镜的设计特点:

1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole

2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面

3.具有扫描系统——逐点扫描成像

4.激光作为光源

5.具有多种（四个）荧光通道，可同步探测多种被标识物;FluorescentMicroscope;;电子显微镜的缺陷：

1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难.

2.样品制备过程（固定、包埋、切片）导致的假象

荧光显微镜的缺陷:

1.无法实现对荧光,透射光的同步采集,无法实现多荧光的同步采集

2.荧光散射光太强，导致实际辨别率的大大下降。

3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。

4.无法对样品进行断层扫描,完毕3D的工作.

5.对于信号较弱的样本,无法提高观测的敏捷度.

6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内构造高度重叠;激光共聚焦显微镜的应用;时间辨别和迅速扫描动态图像;;Hela

green-中心体

red-纺锤体;二.光学切片和三维重组

光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学观测，并揭示亚细胞构造的空间关系，用以阐明三维构造与组织功能之间的关系。;显微CT与三维重组;3Dreconstruction;三.动态测量

游离Ca2+,Mg2+、K+、Na+测量

pH值的检测

;相对测量

程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不一样步间

序列的扫描测量

?F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)

;;FRAP(Fluorescencerecoveryafterphotobleaching)原理;荧光光漂白后的答复：FRAP

生物膜脂质分子的侧向扩散；

胞间通讯的研究；

胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等

细胞骨架构成、核膜构造及大分子组装等。;;荧光共振能量转移（FRET）技术

生物大分子构造和功能研究

免疫分析

核酸杂交分析

蛋白质间互相作用研究

r:分子间距离

R0:分子间发生50%能量转移的距离;检测

以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检

测到FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出

FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。

应用：检测大分子的互相作用

?大分子构象的变化(蛋白)

例：大分子(亚基)的结合与分离

?受体与配体的结合

?常用荧光探剂：FITC/TRITC,Cy3/Cy5,BFP/GFP ;曲霉营养菌丝横隔;植物学应用:

植物细胞中的微管列阵(microtubulearray);农业的应用:

植物细胞中的微丝分布;农业的应用:

花粉萌发过程中微丝骨架的变化;农业的应用:

Jasplakinolide解聚微丝的实时观测;;;;GFP-MAP4融合蛋白体现显示微管骨架（美国Cyr试验室）;奶山羊发育中乳腺上皮细胞重要细胞器的变化;重要试剂及耗材

DMSO购自Sigma企业；

优质胎牛血清（FBS）、DF12培养基、I型胶原酶均购自Gibco企业；

内质网荧光探针（E-34251，激发/发射波长为504/511nm）、

线粒体荧光探针（M-7512，激发/发射波长为579/599nm）、

Hochest33258均购自Invitrogen企业。

Confocal专用细胞培养皿购自北京博蕾德科技企业。;乳腺上皮细胞重要细胞器的检测

37℃预热、终浓度为50nmol/L的M-7512工作液，37℃染色40min；

37℃预热、终浓度为1μmol/L的E-34251工作液，37℃染色30min

10μg/ml的Hochest33258复染5min

图像采集与数据处理

激光扫描共聚焦显微镜使用三通道（PMT）检测。

激发谱线：405nm（激发Hochest33258标识的蓝色荧光，染核

488nm（激发E-34251标识的绿色荧光，染内质网）

543nm（激发M-7512标识的红色荧光，染线粒体）。

扫描模式为xyz，以0.4μm的Z轴步距逐层扫描，点平均2次，面平均4次，三个通道序列扫描成像，overlay处理后采图保留。