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流式细胞仪原理与应用

流式细胞仪原理与应用流式细胞术FlowCytometry,FCM是七十年代发展起

来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学

于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,

还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在血液学、免疫学、肿

瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。流式细胞仪的技术指标与主要构造:?

流动室及液流驱动系统?激光光源及光束形成系统?光学系统?信号检测与存储、显

示、分析系统?细胞分选系统。主要技术指标1(流式细胞仪的分析速度:一般流

式细胞仪每秒检测1000,5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。2(流式细胞

仪的荧光检测灵敏度:一般能测出单个细胞上600个荧光分子,两个细胞间的荧光

差,5%即可区分。3(前向角散射(FSC)光检测灵敏度:前向角散射(FSC)反映被测细

胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm,,.5μm。4(流式细胞仪的分辨率:

通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到2.0%,这也是测量标本前

用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。5(流式细胞仪的分选速度:一般流式细胞

仪分选速度,1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。主要构造和工作原理:流动

室及液流驱动系统流动室(Flow?Cell或Flow?Chamber)是流式细胞仪的核心部

件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室

内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约

束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的

鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系

列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力,?鞘液流包绕样

品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间

相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。流动室孔径有60μm、100μm、

150μm?、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流

动室。主要构造和工作原理:激光光源及光束形成系统流式细胞仪可配备一根或

多根激光管，常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488ηm,此外可

配备氦氖离子气体激光管(波长633ηm)和/或紫外激光管。流式细胞仪的主要测

定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关，

激光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度、高稳定性

的光照，正是能达到这一要求的理想的激发光光源。

在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形

的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束22μm×66μm，在这种椭圆形激

光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。主要构

造和工作原理:光学系统流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组

成，大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组

成，透镜和小孔(一般为2片透镜、1个小孔)的主要作用是将激光光源发出的横截

面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分

布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰;流动

室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信

号送到不同的光电倍增管。滤光片主要有三类:长通滤片(LP)--只允许特定波长以

上的光线通过，短通滤片SP--?只允许特定波长以下的光

线通过，带通滤片BP--?只允许特定波长的光线通过，不同组合的滤片可以

将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管PMT,如接收绿色荧光FITC的PMT

前面配置的滤光片是LP550和BP525,?接收色橙红色荧光PE的PMT前面配置的滤

光片是LP600和BP575,?接收红色荧光CY5的PMT前面配置的滤光片是LP650和

BP675。主要构造和工作原理:信号检测系统?当测定标本在鞘流液约束下细胞成

单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为

前向角散射(Forward?Scatter,?FS)和侧向角散射或900散射

(Side?Scatter,?SS),散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备(如染色)无关;荧

光信号也有两种