DB15T 3534—2024籽用西葫芦叶片三种病毒RT-PCR检测技术规程.docxVIP

ICS65.020.01CCSB04

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T3534—2024

籽用西葫芦叶片三种病毒RT-PCR检测技术规程

TechnicalcodeofpracticeforRT-PCRdetectionofthreeviruses

fromleavesofseed-usedpumpkin(CucurbitapepoL.)

2024-06-28发布2024-07-28实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。

本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（SAM/TC25）归口。

本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古弘昌农业有限责任公司、呼和浩市农牧技术推广中心。

本文件主要起草人：王萍、龙建国、刘杰才、陈贵华、苏利民、孙婧、许珂、尚鹏。

籽用西葫芦叶片三种病毒RT-PCR检测技术规程

1范围

本文件规定了籽用西葫芦叶片三种病毒RT-PCR检测技术中涉及的术语和定义、试剂与材料、仪器和设备、对照设置、样品采集、样品病毒检测、结果分析。

本文件适用于籽用西葫芦叶片中黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、西瓜花叶病毒（Watermelonmosaicvirus，WMV）、小西葫芦黄化花叶病毒（Zucchiniyellowmosaicvirus，ZYMV）的RT-PCR检测。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

黄瓜花叶病毒Cucumbermosaicvirus

属于雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒（Cucumovirus），可以侵染1000多种植物。主要通过蚜虫以非持久方式传播，也是典型的种传病毒。黄瓜花叶病毒一般为系统侵染植物，主要表现为叶片斑驳花叶，叶肉浅绿，叶脉深绿；严重时呈现叶片皱缩，叶肉退化，蕨叶等症状。

3.2

西瓜花叶病毒Watermelonmosaicvirus

属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），在自然界中通过蚜虫以非持久性方式传播，也可经汁液摩擦接种传播。受侵染的病株叶片表现花叶、畸形、新生叶片扭曲，植株生长受阻，果实畸形。

3.3

小西葫芦黄化花叶病毒Zucchiniyellowmosaicvirus

属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），可由多种蚜虫以非持久性方式传播，也能通过种子传播。小西葫芦黄化花叶病毒表现为系统侵染，整株花叶、黄化、叶片皱缩、果实畸形、表面有泡状或者瘤状突起。

4试剂与材料

4,1试剂

琼脂糖、核酸染料、PremixTaq酶、TRIzol试剂、PCR产物回收试剂盒、TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix试剂盒、pMD18-T载体、大肠杆菌感受态细胞DH5a、DNA分子量标准：可以清楚区分100bp～500bp的DNA片段。

4.2溶液配制

4.2.110mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加水定容至200mL。

4.2.20.5mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液(pH8.0)：称取18.6g乙二胺四乙酸二钠，加入

70mL水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液(见4.3)直至EDTA-Na2完全溶解，用氢氧化钠溶液(见4.3)调pH至8.0加水定容至100mL。在121℃条件下灭菌20min。

4.2.31mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)溶液(pH8.0)：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0加水定容至1000mL。在121℃条件下灭菌20min。

4.2.4TE缓冲液(pH8.0)：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(见4.5)和2mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见4.4)，加水定容至1000mL。在121℃条件下灭菌20min。

4.2.550×TAE缓冲