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试验课要求
预习
不迟到、早退、不旷课、有事请假
穿白大褂、注意自我防护
不能喧哗,不做与试验无关事
认真完成试验汇报
值日要求:擦桌子、拖地、擦黑板、倒垃圾、关灯和门窗
实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化专家讲座
第1页
一、试验目标
二、试验原理
三、试验仪器及试剂
四、试验步骤
五、注意事项
六、数据处理及计算
试验一兔血清免疫球蛋白分离
实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化专家讲座
第2页
一、试验目标
学习并掌握盐析法原理及用盐析法进行免疫球蛋白分离与纯化技术。(IgG)
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抗体结构
抗体分子是由两条轻链(lightchain,L链)和两条重链(heavychain,H链)经过链间二硫键连接而成。
实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化专家讲座
第4页
二、试验原理一盐析
当用中性盐加入蛋白质溶液,中性盐对水分子亲和力大于蛋白质,于是蛋白质分子周围水化膜减弱甚至消失;同时,中性盐加入蛋白质溶液后,因为离子强度发生改变,蛋白质表面电荷大量被中和,愈加造成蛋白质溶解度降低,使蛋白质分子之间聚集而沉淀,这个过程叫做盐析。
实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化专家讲座
第5页
试验原理-盐析
不一样蛋白质因为所带电荷不一样以及水化程度不一样,加入不一样浓度中性盐可分阶段从溶液中沉淀出来。
蛋白质盐析中最惯用盐是硫酸铵
硫酸铵分级沉淀
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三、试验仪器及试剂
1.试验材料:血清(兔免疫血清)。
2.试剂:0.01mol/LpH7.4PBS、0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、饱和硫酸按(用前以5mol/LNaOH调至pH7.4)、奈氏试剂。
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三、试验仪器及试剂
3.用具:三角瓶、烧杯、各种吸管、小试管、量筒、布氏漏斗、透析袋(用前用PBS或双蒸水煮沸10min)、饭盒(装碎冰)等。
4.仪器:搅拌器、离心机等。
5.溶液配制
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三、试验试剂
饱和硫酸铵溶液配制:
称(NH4)2SO4400~425克,以70~80℃之蒸馏水500ml溶解,搅拌20分钟,趁热过滤。冷却后以浓氨水(28%氨溶液)调PH至7.4。配制好饱和硫酸铵,瓶底应有结晶析出。
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磷酸盐缓冲液
0.2M,PH7.4磷酸盐缓冲盐液(PhosphateBufferedSalinePBS)配制。
贮存液:
A液:0.2MNaH2PO4:NaH2PO4·2H2O31.2克,加蒸馏水至1000ml;
B液:0.2MNa2HPO4:Na2HPO4·12H2O71.7克,加蒸馏水至1000ml;
应用液:取A液19ml加B液81ml混合,再以生理盐水作10倍稀释,加入NaCl至终浓度为0.85%,即为PBS。
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柰氏试剂
HgI11.5g,KI8.0g,加双蒸水至50ml;搅拌溶解后过滤,滤液中再加入浓度为20%溶液NaOH50ml。
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四、试验步骤
1兔免疫血清制备
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2硫酸铵分级沉淀
(1)取制备好血清20ml,逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液20ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置10min。
(2)3000r/min离心10min,弃去上清。
(3)用6ml磷酸盐缓冲液溶解沉淀,再加(NH4)2SO4饱和溶液3ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合,静置10min。
(4)3000r/min离心10min,弃上清。
(5)为深入纯化,可重复步骤32~3次。
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3透析去盐
(6)用5mlPBS溶解沉淀,装入透析袋。
(7)透析除盐,中间换液数次,至奈氏试剂测透析外液无黄色。
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第14页
五、数据处理及计算
蛋白含量(mg/mL)=
(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×样品稀释度
注:式中1.45与0.74为常数,nm为波长。
蛋白质及其定量判定:取样品少许作适量稀释,以紫外分光光度计测量蛋白含量
260、280nm处读数
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试验汇报要求
题目、原理、主要试剂与器材、步骤、结果、注意事项(心得体会)
班级、姓名、学
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