实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化专家讲座.pptx

试验课要求

预习

不迟到、早退、不旷课、有事请假

穿白大褂、注意自我防护

不能喧哗，不做与试验无关事

认真完成试验汇报

值日要求：擦桌子、拖地、擦黑板、倒垃圾、关灯和门窗

实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化专家讲座

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一、试验目标

二、试验原理

三、试验仪器及试剂

四、试验步骤

五、注意事项

六、数据处理及计算

试验一兔血清免疫球蛋白分离

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一、试验目标

学习并掌握盐析法原理及用盐析法进行免疫球蛋白分离与纯化技术。（IgG）

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抗体结构

抗体分子是由两条轻链(lightchain,L链)和两条重链(heavychain,H链)经过链间二硫键连接而成。

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二、试验原理一盐析

当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围水化膜减弱甚至消失；同时，中性盐加入蛋白质溶液后，因为离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，愈加造成蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀，这个过程叫做盐析。

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试验原理-盐析

不一样蛋白质因为所带电荷不一样以及水化程度不一样，加入不一样浓度中性盐可分阶段从溶液中沉淀出来。

蛋白质盐析中最惯用盐是硫酸铵

硫酸铵分级沉淀

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三、试验仪器及试剂

1.试验材料：血清（兔免疫血清）。

2.试剂：0.01mol/LpH7.4PBS、0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、饱和硫酸按（用前以5mol/LNaOH调至pH7.4）、奈氏试剂。

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三、试验仪器及试剂

3.用具：三角瓶、烧杯、各种吸管、小试管、量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用PBS或双蒸水煮沸10min）、饭盒（装碎冰）等。

4.仪器：搅拌器、离心机等。

5.溶液配制

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三、试验试剂

饱和硫酸铵溶液配制：

称（NH4）2SO4400～425克，以70～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水（28%氨溶液）调PH至7.4。配制好饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。

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磷酸盐缓冲液

0.2M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（PhosphateBufferedSalinePBS）配制。

贮存液：

A液：0.2MNaH2PO4：NaH2PO4·2H2O31.2克，加蒸馏水至1000ml；

B液：0.2MNa2HPO4：Na2HPO4·12H2O71.7克，加蒸馏水至1000ml；

应用液：取A液19ml加B液81ml混合，再以生理盐水作10倍稀释，加入NaCl至终浓度为0.85%，即为PBS。

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柰氏试剂

HgI11.5g，KI8.0g，加双蒸水至50ml；搅拌溶解后过滤，滤液中再加入浓度为20%溶液NaOH50ml。

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四、试验步骤

1兔免疫血清制备

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2硫酸铵分级沉淀

（1）取制备好血清20ml，逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液20ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置10min。

（2）3000r/min离心10min，弃去上清。

（3）用6ml磷酸盐缓冲液溶解沉淀，再加（NH4）2SO4饱和溶液3ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置10min。

（4）3000r/min离心10min，弃上清。

（5）为深入纯化，可重复步骤32~3次。

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3透析去盐

（6）用5mlPBS溶解沉淀，装入透析袋。

（7）透析除盐，中间换液数次，至奈氏试剂测透析外液无黄色。

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五、数据处理及计算

蛋白含量（mg/mL）＝

（1.45×OD280nm－0.74×OD260nm）×样品稀释度

注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。

蛋白质及其定量判定：取样品少许作适量稀释，以紫外分光光度计测量蛋白含量

260、280nm处读数

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试验汇报要求

题目、原理、主要试剂与器材、步骤、结果、注意事项（心得体会）

班级、姓名、学