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第十章蛋白质研究方法与原理;第一节概述;蛋白质分离纯化包含以下过程:
1.破碎生物组织,并用适当缓冲液将蛋白质抽提出来;
2.将相关蛋白质分级沉淀下来;(盐析法或有机溶剂法)
3.应用层析法或电泳法使它们各自分开;
4.蛋白质结晶;
5.蛋白质纯度判定和含量测定。;制备过程中注意事项:
要求自始至终保持在天然状态
防止一切过激原因--如过酸或过碱,高温,
重金属等影响。
2.通常都在低温条件下操作。
3.尽可能使样品中蛋白质浓度维持在较高
水平。
;第二节蛋白质分离与纯化技术;一、蛋白质沉淀与结晶;(一)盐析法
概念:将中性盐加入蛋白质溶液,破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀,叫盐析。各种蛋白质盐析所需盐浓度及PH不一样,加入不一样浓度中性盐可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。
优点:操作简便
对易变性蛋白质有一定保护作用,
适用范围十分广泛。
缺点:分辨能力差,纯化倍数低;
(1)盐种类
对同一个Pr而言,价数愈高盐离子,盐析能力
也愈强:
PO3-4>SO42->C2O42->(CHOHCOO-)2>
AC->CL->NO3->Br->I->CNS-
K+>Rb+>Na+>Cs+>Li+>NH4+
惯用中性盐有如硫酸盐、磷酸盐等。;硫酸铵(惯用盐析剂)
优点:盐析能力较强
含有较高溶解度
较低溶解度温度系数
价格低廉
不产生副作用。
缺点:缓冲能力较差
PH难控制
;(2)PH和温度
S。代表蛋白质在无机盐溶液中溶解度
除取决于Pr种类,还受PH及温度影响:
PH=PI时,S。数值极小
S。随温度增加而减低。
盐析过程中,若增高温度,有利于Pr析出。;
(3)蛋白质浓度
[Pr]较高,在较低无机盐浓度时,蛋白质便开
始析出,盐析界限比较宽。
[Pr]较低,需要无机盐浓度也高,即盐析
界限变窄。;1.基本原理
(1)在PI附近,Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加
有机溶剂,因为有机溶剂可使溶液电离常数减小,增强了
中性离子间静电引力,从而使分集合而沉淀出来。
(2)有机溶剂本身水合作用会??坏Pr表面水合层,也
促使Pr变得不稳定而聚集析出.
惯用有机溶剂:乙醇和丙酮;(三)选择性沉淀法;(四)蛋白质结晶;二、离心技术分离蛋白质;三、层析技术分离纯化蛋白质;
气相层析
按两相状态来分液相层析
吸附层析
分配层析
离子交换层析
按层析机理来分凝胶排阻层析
亲和层析
柱层析
按操作方式来分薄层层析
纸层析;(一)凝胶过滤层析
又称分子筛或凝胶过滤(gelfiltration)
原理:载体为有一定孔径多孔性亲水性凝胶。当分子大小不一样混合物经过这种凝胶柱时,直径大于孔径分子将不能进入凝胶内部,便直接沿胶粒间隙流出(全排出)。较小分子进入能容纳它孔穴,绕道而行,在柱内保留时间就比较长。这么,较大分子被先洗脱下来,而较小分子后被洗脱下来,从而到达相互分离目标。;蛋白质的研究方法与原理专家讲座;离子交换层析法
*原理:阴(阳)离子交换树脂颗粒(作为固定相)
填充在层析柱内,因为阴(阳)离子交换树
脂颗粒上带正(负)电荷,能吸引溶液中
阴(阳)离子。然后再用含阴(阳)离子
溶液洗柱。含负电量小蛋白质首先被洗脱
下来,增加阴离子浓度,含负电量多蛋白
质也被洗脱下来,于是两种蛋白质被分开。;蛋白质的研究方法与原理专家讲座;
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