蛋白质的研究方法与原理专家讲座.pptxVIP

第十章蛋白质研究方法与原理;第一节概述;蛋白质分离纯化包含以下过程：

1.破碎生物组织，并用适当缓冲液将蛋白质抽提出来；

2.将相关蛋白质分级沉淀下来;（盐析法或有机溶剂法）

3.应用层析法或电泳法使它们各自分开；

4.蛋白质结晶；

5.蛋白质纯度判定和含量测定。;制备过程中注意事项：

要求自始至终保持在天然状态

防止一切过激原因--如过酸或过碱，高温，

重金属等影响。

2.通常都在低温条件下操作。

3.尽可能使样品中蛋白质浓度维持在较高

水平。

;第二节蛋白质分离与纯化技术;一、蛋白质沉淀与结晶;（一）盐析法

概念：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需盐浓度及PH不一样，加入不一样浓度中性盐可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。

优点：操作简便

对易变性蛋白质有一定保护作用，

适用范围十分广泛。

缺点：分辨能力差，纯化倍数低;

（1）盐种类

对同一个Pr而言，价数愈高盐离子，盐析能力

也愈强:

PO3-4＞SO42-＞C2O42-＞（CHOHCOO-）2＞

AC－＞CL－＞NO3-＞Br-＞I-＞CNS-

K+＞Rb+＞Na+＞Cs+＞Li+＞NH4+

惯用中性盐有如硫酸盐、磷酸盐等。;硫酸铵（惯用盐析剂）

优点：盐析能力较强

含有较高溶解度

较低溶解度温度系数

价格低廉

不产生副作用。

缺点：缓冲能力较差

PH难控制

;（2）PH和温度

S。代表蛋白质在无机盐溶液中溶解度

除取决于Pr种类，还受PH及温度影响:

PH=PI时，S。数值极小

S。随温度增加而减低。

盐析过程中，若增高温度，有利于Pr析出。;

（3）蛋白质浓度

[Pr]较高，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开

始析出，盐析界限比较宽。

[Pr]较低，需要无机盐浓度也高，即盐析

界限变窄。;1.基本原理

（1）在PI附近，Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加

有机溶剂，因为有机溶剂可使溶液电离常数减小，增强了

中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。

（2）有机溶剂本身水合作用会??坏Pr表面水合层，也

促使Pr变得不稳定而聚集析出.

惯用有机溶剂：乙醇和丙酮;（三）选择性沉淀法;（四）蛋白质结晶;二、离心技术分离蛋白质;三、层析技术分离纯化蛋白质;

气相层析

按两相状态来分液相层析

吸附层析

分配层析

离子交换层析

按层析机理来分凝胶排阻层析

亲和层析

柱层析

按操作方式来分薄层层析

纸层析;（一）凝胶过滤层析

又称分子筛或凝胶过滤（gelfiltration）

原理：载体为有一定孔径多孔性亲水性凝胶。当分子大小不一样混合物经过这种凝胶柱时，直径大于孔径分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出（全排出）。较小分子进入能容纳它孔穴，绕道而行，在柱内保留时间就比较长。这么，较大分子被先洗脱下来，而较小分子后被洗脱下来，从而到达相互分离目标。;蛋白质的研究方法与原理专家讲座;离子交换层析法

*原理：阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相）

填充在层析柱内，因为阴（阳）离子交换树

脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中

阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子

溶液洗柱。含负电量小蛋白质首先被洗脱

下来，增加阴离子浓度，含负电量多蛋白

质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。;蛋白质的研究方法与原理专家讲座;