细菌基因缺失株的构建方法.pptxVIP

汇报提纲基本概念1.Red重组系统介绍2.重组自杀性质粒方法介绍3.细菌基因缺失株的构建方法第1页

一、基本概念基因同源重组（homologousrecombination），又叫基因打靶（genetargeting），是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上同源序列之间发生重组，并整合在预定位置上，从而改变了细胞一些遗传特征方法，重组目标是为了敲除某个基因。细菌基因缺失株的构建方法第2页

背景利弊二、Red重组系统介绍组成原理Red重组系统细菌基因缺失株的构建方法第3页

1、背景二、Red重组系统介绍敲除细菌基因传统方法是利用RecA重组系统。RecA重组系统是大肠杆菌内源性同源重组体系，它由RecA蛋白和RecBCD蛋白组成。这种方法需要较长靶基因同源序列，还需构建含有靶位点质粒，重组效率较低。最近由Murphy和Stewart等人用噬菌体Red重组系统在大肠杆菌中建立快速敲除原核基因方法简化了试验操作，使试验周期大大缩短。这种重组技术是一项可在染色体水平上进行遗传操作新技术，只需较短同源序列，而不需要特定限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组过程，省去了体外DNA酶切、连接等步骤。细菌基因缺失株的构建方法第4页

2、组成二、Red重组系统介绍质粒pKD46：为同源重组辅助质粒，含温度敏感型复制子，高于37℃该质粒会丢失，阿拉伯糖诱导后能够表示Gam、Beta和Exo3个λ噬菌体重组酶。细菌基因缺失株的构建方法第5页

2、组成二、Red重组系统介绍质粒pKD3：为PCR扩增提供氯霉素抗性基因模板，氯霉素抗性基因两侧有FRT位点(FLP重组酶识别位点)，为重组转化子提供筛选标志。细菌基因缺失株的构建方法第6页

2、组成二、Red重组系统介绍质粒pCP20：是含有氨苄青霉素(Amp)抗性和氯霉素(Cm)抗性质粒，含有温度敏感型复制子，能够表示FLP重组酶，42℃诱导下FLP重组酶得到表示，质粒也逐步丢失，该质粒用于消除FRT位点间cat基因。细菌基因缺失株的构建方法第7页

3、原理二、Red重组系统介绍HX4电转HX4扩增电转HX4HX4HX4HX4细菌基因缺失株的构建方法第8页

4、利弊二、Red重组系统介绍以Red重组系统为基础基因敲除是最近研究较热技术方法，对研究微生物基因功效含有主要促进作用。它与传统基因敲除方法相比，重组效率显著提升，而且此方法利用线性打靶DNA，不需构建打靶质粒，所以试验周期大大缩短。但到当前为止，此系统还主要应用于大肠杆菌基因整合和敲除，在其它菌株取得成功实例较少，详细原因尚不明确。细菌基因缺失株的构建方法第9页

三、重组自杀性质粒方法介绍自杀性质粒简介原理细菌基因缺失株的构建方法第10页

三、自杀质粒方法介绍构建含一定长度同源DNA片段重组自杀质粒，利用宿主本身重组系统与同源重组序列交换，而经两次重组过程最终完成重组。这种重组技术可直接对宿主染色体进行修饰，并在各种革兰氏阴性菌中得到应用。当前，高效自杀性载体系统和Red同源重组系统均能够对革兰氏阴性菌染色体直接进行修饰，但Red同源重组系统将在染色体中残留FRT位点，而自杀性载体系统在染色体中除目标基因外，不保留任何外源DNA，利用该技术能够取得含有完全生物安全意义重组疫苗株。1、简介自杀质粒：通常为R质粒衍生质粒，含有接合转移基因。它复制需要一个特殊蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白质，所以，当进入寄主细胞时，要么不能复制，被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一起复制。利用自杀质粒这个特点，将基因工程技术构建基因缺失DNA片断，克隆入自杀质粒，利用缺失基因两端同源片断，定位自杀质粒整合位点。利用同源性DNA片断可发生重组原理，构建准确基因缺失菌株。在多数情况下，利用自杀质粒，可随心所欲缺失大多数基因任何部分。细菌基因缺失株的构建方法第11页

三、重组自杀性质粒方法介绍2、原理细菌基因缺失株的构建方法第12页

三、重组自杀性质粒方法介绍2、原理细菌基因缺失株的构建方法第13页

2、原理三、重组自杀性质粒方法介绍细菌基因缺失株的构建方法第14页

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