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一、准备工作
进样小瓶:(1)无水乙醇浸泡过夜(2)自来水冲洗8次以上,再用滤过的娃哈哈矿泉水清洗数次(3-8次)(3)烘干,待用。
色谱级甲醇溶液、色谱级乙腈溶液及娃哈哈矿泉水用砂芯滤器过滤。注意:
先过滤娃哈哈矿泉水:先用自来水清洗砂芯滤器,再用娃哈哈清洗砂芯滤器。水相滤膜(两层,0.45um)用娃哈哈水湿润后,放在砂芯上,按图片装好滤器装置。先倒入少量娃哈哈水,看是否有漏液,如没有可大量加入娃哈哈。滤完后,将水重新装入瓶中。
滤甲醇:将滤器先用自来水清洗一遍,再用甲醇润洗一遍。用两层有机相滤膜(0.45um)过滤。
滤乙腈:将滤器先用自来水清洗一遍,再用乙腈润洗一遍。用两层有机相滤膜(0.45um)过滤。
将滤好的溶液,盖旋松,放入超声清洗仪中超声10分钟,以赶走溶液中的气泡。超声结束后,拧紧瓶盖。
清洗滤器,收好。
二、HPLC
仪器的打开
从上往下打开HPLC仪器
打开泵的开关
打开电脑及Instrument1online软件。(最好等HPLC仪器自检结束后再打开软件。)
冲洗系统
换A、B相:A相为水,B相为甲醇;探头要置底
打开排气阀,以排出系统内的气泡。设置流速为3ml/min,AB相各50%。看1、2、A、B管路有无气泡。待排完气泡后,流速调为0ml/min,关上排气阀。
把B相调为100%,流速慢慢往上升(先0.3ml/min,后0.6ml/min,最后1ml/min)。压力稳定就网上调。
流速打到1ml/min后,冲洗10min。
待压力线和UV检测线平行后,慢慢降低流速(先从 1ml/min到0.6ml/min,再到0.3ml/min,最后0ml/min。)
冲洗柱子
接色谱柱及预柱。如图。注意方向。预柱是大头进,小头出;色谱柱看箭头,箭头指向流出的方向。
接完柱子后,慢慢往上调流速1ml/min(先0.2,再0.4,再0.6,再0.8,最后1ml/min),直至两条线平行(检测线和压力线),线平行后至少要平行5min,才可以往上调。当流速1ml/min,且线平行5min后,慢慢降低流速至0(先1ml/min到0.8,再0.6,再0.4,再0.2,最后0ml/min)。
样品的检测
将甲醇换为乙腈,流动相比例调整为,30%B及70%A。将流速慢慢往上调至1ml/min
(先0.2,再0.4,再0.6,再0.8,最后1ml/min),直至两条线平行。设置检测的参数、保存方法,开始检测样品。
样品检测完后,慢慢降低流速至0(先1ml/min到0.8,再0.6,再0.4,再0.2,最后0ml/min)。
更换流动相,将乙腈换为甲醇,调整流动相比例,先B10%,流速慢慢上升(先0.2,再0.4,再0.6,再0.8,最后1ml/min),冲洗系统至两线平行,流速慢慢降至0ml/min。再调整流动相比例为B100%,流速慢慢上升(先0.2,再0.4,再0.6,再0.8,最后1ml/min),冲洗系统至两线平行,流速慢慢降至0ml/min。卸柱。
从下往上关闭HPLC仪器。
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