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用家蚕幼虫蛹表达外源基因的方法

专利名称：用家蚕幼虫蛹表达外源基因的方法

技术领域：

本发明是一种用家蚕幼虫、蛹表达外源基因的方法，属基因

工程领域。

大肠杆菌、酵母等微生物系统已用于表达外源基因进行生产，

并形成了一些基因工程产品。但由于大肠杆菌的表达产物形

成一种不溶解的包函体故需要加变性剂溶解和恢复天然结

构。动物细胞作为外源基因表达系统，其特点是表达产物保

持天然的三维结构，能将蛋白质侧链进行糖基化，去掉基因

中的内函子，翻译后产物的修饰加工，分泌等都在细胞内完

成，但是动物细胞培养价格昂贵，周期长，条件要求严格而

且表达有限，大量培养需要特定技术与设备。因而近年来人

们试图以昆虫细胞作为寄主细胞成为外源基因的表达系统，

较为成效的有1.前田进，细胞工学vol.4，767-790，1985

年所述，将家蚕核多角体病毒构成的载体质粒插入目的基因

与家蚕核多角体病毒DNA共同感染家蚕离体培养的细胞中，

在家蚕细胞内重组，并进而感染家蚕幼虫在体内表达。家蚕

易被人工饲养，但是家蚕病毒构成的载体质粒插入的外源目

的基因只能和家蚕病毒一起感染家蚕细胞或家蚕幼虫，仍有

局限性。

2.D.summers，Bio/Technology，vol.6.48-55.1988年所述，

采用苜蓿银纹夜蛾AutographaCalifornica核多角体病毒

(以下简称ACNPV)已构成带有不同外源目的基因的多

ACNPV载体质粒，它与ACNPVDNA一起感染草地贪夜蛾

Spodopterafrugiperda(以下简称sf)离体细胞，在其中重

组表达，山于细胞培养产量低，速度慢而且草地贪夜蛾很难

人工大量饲养，无法形成基因工程产品。

本发明目的是为了得到一种高效表达，成本低，又适合于人

工饲养的一种基因工程方法，即采用已构成带有不同外源目

的基因的各ACNPV载体质粒，使它能与家蚕病毒DNA共同

感染家蚕离体细胞，得到的杂交重组病毒感染到家蚕幼虫和

蛹体内，在其体内能得到基因表达。

本发明是这样实现的1.病毒和细胞家蚕细胞株Bm-N细胞在

BML/TC-10培养基培养。用家蚕核多角体病毒感染2-5令家

蚕幼虫增殖病毒，用蔗糖密度梯度超离心法提纯。

2.病毒DNA的制备经纯化后的家蚕核多角体病毒用0.25M氯

化钠和蒸馏水洗涤后用碱性碳酸钠缓冲液37℃保温2小时溶

解，离心除去不溶物，上清液用苯酚抽提，离心，水相再用

氯仿抽提，最后将水相对重蒸馏水透析过夜，应用此法制备

的核多角体病毒DNA用于家蚕细胞株Bm-N细胞的转染重组。

3.质粒PAC360，PAC373，PAC700，PBlueBac等系列质粒

都可在大肠杆菌中增殖，用苯酚提取，用琼脂糖-4B层析柱

纯化。

4.细胞内重组及重组病毒的筛选将带有外源目的基因的

ACNPV质粒0.1-5微克及家蚕核多角体病毒DNA0.2-10微克

悬浮于950微升转染缓冲液(10-50mMHEPES，0.7mMNa2HPO4，

20-100mMNaCl，4-10mM葡萄糖，5mMKCl，0.1-10μg/ml小

牛胸腺DNA，PH6.8-8.2)中加10-100μl2.5MCaCl2溶液，

室温放置30分钟，使之形成纤细状沉淀，将其加入单层家

蚕细胞，25-30℃培养5-10小时，吸弃转染液，换培养液，

在25-30℃继续培养2-5天，直至病毒多角体形成。取上述

转染的细胞培养液经稀释后取2ml加至培养皿培养单层家蚕

细胞上，25-30℃保温2-4小时后，吸弃感染液，用培养液

漂洗单层细胞，在单层细胞上复盖1-2%琼脂凝胶，琼脂凝胶

复层用培养液培制含200μg/ml5-氯-4-溴-3-吲哚β-D-半

乳糖苷(x-gal)，25-80℃培养4-6天至兰色空斑形成，挑取

兰色空斑，再次重复做空斑测定，分离重组病毒。

5.重组病毒对家蚕幼虫、蛹的感染采用针刺、注射、口服的

接种方法将病毒感染到2-5令家蚕幼虫和家蚕蛹体内。

本发明扩大了ACNPV构成的载体质粒的应用范围，使目前重

组的ACNPV在草地贪夜蛾离体培养细胞表达产物可以转入家

蚕幼虫或蛹体内进行培养，家蚕饲养在我国已有悠久历史，

很易形成一定规模的基因工程产品的产业，因而具有重