《NADH氧化酶活力的测定》征求意见稿.docx

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NADH氧化酶活力的测定分光光度法

1范围

本文件描述了测定NADH氧化酶活力的分光光度法。

本文件适用于生化试剂、工业酶制剂中NADH氧化酶活力的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

NADH氧化酶活力单位NADHoxidaseactivityunit

在30℃、pH7.0的条件下，每分钟氧化1μmolNADH所需的酶量为一个酶活力单位，单位为U。

4原理

NADH氧化酶催化底物NADH的氧化生成NAD+，NAD+在340nm下无吸收，而NADH有吸收，其ε340=6.22mM-1cm-1，通过监测340nm下吸光度的变化来测定NADH的消耗，计算酶活力。

5试剂

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。

5.1还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）：CAS号606-68-8，纯度≥98%。

5.2黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）：CAS号84366-81-4，纯度≥95%。

5.3三羟基甲基氨基甲烷（Tris）-HCl缓冲液：50mmol/L，pH7.0。

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5.4反应底物溶液：含0.13mmol/LNADH、0.1mmol/LFAD及50mmol/LTris，pH7.0。使用分析天平准确称取9.2mgNADH和8.3mgFAD溶解在100mL的Tris-HCl缓冲液（5.4）

中，充分混匀，现用现配。

6仪器设备

6.1分析天平：感量为0.001mg。

6.2pH计：精度为0.01。

6.3紫外-可见分光光度计：带有温控比色皿槽，波长精度为1nm，吸光度值精度为0.001。

6.4石英比色皿：1cm。

6.5移液器：10μL、1000μL。

7试样制备和试验步骤

7.1试样酶液的制备

7.1.1液体样品待测酶液制备

使用移液器移取适量NADH氧化酶液体样品溶于水中进行稀释，使待测酶液活力控制在

15U/mL以下。

7.1.2固体样品待测酶液制备

使用分析天平称取适量NADH氧化酶固体样品（精确至0.0001g）溶于水中，使待测酶液活力控制在15U/mL以下。

7.2测定

使用移液器准确移取1000μL反应底物溶液于石英比色皿中，置于分光光度计的温控比色皿槽内，待温度稳定于30℃±1℃后，迅速用移液器加入10μL待测酶液，加盖颠倒混匀后立即放入分光光度计，在340nm下扫描1min，保存吸光度曲线。通过线性回归方程计算斜率。每个待测酶液平行测定三次。

8试验数据处理

8.1液体样品

试样中NADH氧化酶活力按式（1）计算：

(V

(V1+V2)×K×D

X1=ε×V2(1)

式中：

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X1——NADH氧化酶活力，单位为酶活力单位每毫升（U/mL）；V1——反应底物溶液的体积，单位为微升(μL）；

V2——酶活力测定中加入酶液的体积，单位为微升(μL）；

k——酶活力测定中吸光度曲线斜率，单位为吸光度每分钟（Abs/min）；D——稀释倍数；

ε——吸光系数，单位为mM-1cm-1（取值为6.22mM-1cm-1）。

以三次平行测定结果的算数平均值作为最终的酶活力测定值，计算结果保留三位有效数字。

8.2固体样品

试样中NADH氧化酶活力按式（2）计算：

X2=×···················································(2)

式中：

X2——NADH氧化酶活力，单位为酶活力单位每克（U/g）；V1——反应底物溶液的体积，单位为微升(μL）；

V2——酶活力测定中加入酶液的