GBT 35912-2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒 荧光RT-PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

中华人民共和国国家标准

GB/T35912—2018

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法

Real-timeRT-PCRmethodfordetectionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus

2018-02-06发布2018-09-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会

发布

I

GB/T35912—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。

本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国农业科学院上海兽医研究所、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、湖南圣湘生物科技有限公司、中国检验检疫科学研究院。

本标准主要起草人：张强、李健、熊炜、童光志、赵和平、李树清、花群义、杨忠苹、李国新、王巧全、王艳、林颖峥、蔡开妹、喻正军、林祥梅、吴绍强。

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GB/T35912—2018

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。本标准适用于猪繁殖与呼吸道综合征病毒美洲型毒株核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Real-timeRT-PCR:荧光反转录聚合酶链式反应(real-timereversetranscriptpolymerasechainre-action)

Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数(cyclethreshold)RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)

Taq酶：TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTAbuffer)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)

PRRSV:猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsolution)

4仪器

4.1荧光PCR检测仪。

4.2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。

4.3组织研磨器或者研钵。

4.4普通冰箱：2℃~8℃。

4.5超低温冰箱：可控温至一70℃以下。

4.6微量移液器：0.2μL～2μL、1μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL,并配备与移液器匹配的吸头。

4.7高压灭菌锅。

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GB/T35912—2018

5耗材

5.11.5mL无RNA酶离心管。

5.20.2mLPCR薄壁管或八联管。

6试剂

6.1除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。

6.2Trizol,商品化RNA抽提试剂，4C～8℃保存。

6.3氯仿：常温保存。

6.4异丙醇：使用前预冷至-20℃

6.5无水乙醇：-20C预冷

6.675%乙醇：无水乙醇和双蒸水配制，-20℃预冷。

6.7DEPC水：配制见A.1,也可购买商品化DEPC水。

6.8PBS:配制见A.2。

6.9Taq酶及10倍Tag酶反应缓冲液：Tag酶浓度为5U/pL,Taq酶反应缓冲液中Mg2+浓度为15mmol/L。

6.10逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为-50UpL,20℃保存，避免反复冻融。

6.11RNA酶抑制剂(40Up);-20℃保存避免反复东融。

6.12dNTPs:含dAT