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原核表达体系的构建
刘华彬，董浚键
一、实验材料
（1）植物材料：拟南芥
（2）载体及菌株：克隆及测序用载体为pMD18-T，购自Takara公司。宿主菌
DH5α。原核表达载体（pET30c？）。
（3）PCR引物：登陆GeneBank查找目的基因序列，以目的基因序列为模板设
计引物。
（4）药品试剂：反转录试剂盒（TaKaRa），质粒小提试剂盒（TIANGEN），胶
回收试剂盒，TaqDNA聚合酶（TaKaRa），dNTPs（TaKaRa），限制性内切
酶（TaKaRa），T4连接酶（TaKaRa），各种DNA和蛋白marker，各种抗
生素类，
二、方法
（1）目的基因的获得（RT-PCR）：拟南芥叶片→mRNA→逆转录→cDNA→PCR
→基因（详见王希朝那份）；PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。
先设计好PCR的引物和PCR的反应程序。
（2）克隆载体的构建：
Ⅰ.目的基因的切胶回收：
①在紫外灯下迅速用干净的手术刀切下含目的基因的琼脂糖凝胶块，放
入已称重的离心管中，在保证目的基因全部回收的同时，应尽量减少胶
的体积。
②计算凝胶重量（100mg相当于100μl），加入3倍体积solutionDE-A，
75℃水浴6-8分钟，其间轻柔地颠倒离心管至胶完全融化。
③加入2倍体积solutionDE-B，颠倒混匀，将溶液转移到吸附柱中，室
温放置1min，12000rpm离心1min。
④取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入600μlWashsolution，室温
12000rpm离心30s。
⑤重复步骤④一次。
⑥取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温12000rpm离心1min。
⑦将吸附柱放入新的1.5mL灭菌离心管中，在柱膜中央加入30μl75℃
预热的ddHO，室温放置2min，12000rpm离心1min。离心管中的液
2
体即为回收的目的基因片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
Ⅱ.目的片断与克隆载体pMD18-T连接：
pMD19-TSimpleVector（T载体，小纸盒子中）1ul
InsertDNA2ul5ul
dH2O2ul
SolutionI（冰中融化，小纸盒子中，跟T载体一起）5ul（等量）
16℃反应30min
Ⅲ.E.coliDH5α感受态细胞的制备：
①将E.coliDH5α在LB平板上划线培养过夜。次日，挑取单克隆，接
种到5mLLB培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜。
②将过夜培养的菌液1mL加入到100mLLB培养基中(1:100)，培养
2-3h至OD=0.5，转入预冷的无菌离心管中，冰上放置10min，然
600
后于4℃下3000rpm离心10min。
③弃去上清，用预冷的0.05mol/L的无菌CaCl溶液10mL轻轻悬浮
2
细胞，冰上放置20min，4℃下3
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