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抗原与蛋白偶联方法

常用的半抗原与蛋白偶联方法

EDAC：EDC是一种羧基和氨基反应零长度交联剂。EDC和与羧基反应形成氨基活化的O酰基异脲

中间体，他可以迅速与氨基反应形成酰胺键，释放异脲副产物。该媒介在水中不稳定，因此两步共

轭反应依赖N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)稳定结构。和氨基失败的反应导致媒介水解，羧基再生，释放N

代尿素。副反应形成N酰基脲，这通常限制羧基定位蛋白的疏水区。

EDC用于偶联半抗原到载体蛋白

原料：

1.载体蛋白：2mg牛血清白蛋白BSA，卵白蛋白OVA或血蓝蛋白KeyholelimpethemocyaninKLH

2.偶联缓冲液：0.1MMES，pH4.5-5

3.EDC：10mg

4.Hapten：1-2mg

5.脱盐柱或凝胶过滤柱5-6KD阻隔。

操作步骤：

1.平衡EDC到室温，加入2mg的BSA、OVA或KLH到200ul偶联缓冲液，如果用热电的载体蛋白用

无菌水溶解。

2.溶解2mg多肽或半抗原到500ul偶联缓冲液加入200ul载体蛋白中。

3.对BSA或OVA结合，溶解10mgEDC到1ml超纯水立即加100ul(1mgEDC)该溶液到载体-多肽溶液

中。对KLH结合溶解10mgEDC到1ml超纯水立即加50ul(0.5mgEDC)该溶液到载体-多肽溶液中，

如果发生沉淀进一步减少EDC用量。

4.室温反应2小时。用脱盐柱纯化偶联蛋白，如果存储免疫原数天，无菌过滤储存在无菌容器中4

或-20度保存。

用EDC和NHS或Sulfo-NHS两步法偶联偶联蛋白

用EDC和Sulfo-NHS活化反应在pH4.5-7.2有效，然而NHS激活或Sulfo-NHS激活的分子具有伯胺

在pH7-8时有效。最好的结果是最初第一步反应在MES缓冲液中(或其他无氨基无羧基缓冲液pH5-6)，

接着用磷酸盐缓冲液提高pH7.2-7.5(或其他无氨基无羧基缓冲液)立即与含氨基分子反应。为了淬灭

第一个反应用2巯基乙醇或其他可以容易去除的试剂，用脱盐柱换液。

原料：

1.活化缓冲液：0.1MMES，0.5MNaCl，pH6.0

2.结合缓冲液：

3.2

4.蛋白1：准备溶解到活化缓冲液中1mg/ml。

5.蛋白2：准备溶解到结合缓冲液中

6.NHS或Sulfo-NHS

7.2-巯基乙醇

8.脱盐柱

9.羟胺-盐酸

操作步骤：

1.开盖前平衡EDC和NHS到室温。

2.加0.4mgEDC(2mM)和0.6mgNHS或1.1mgSulfo-NHS(5mM)到1ml蛋白1溶液中室温反应15min。

3.加1.4ul的2-巯基乙醇(终浓度20mM)淬灭EDC。

4.可选步骤：用PBS平衡的脱盐柱从超量试剂和灭活的交联剂中分离蛋白。

5.按相同摩尔比加蛋白2到活化蛋白1，室温反应2小时。

6.淬灭反应加入羟胺到终浓度10mM，该方法水解蛋白1上未反应的NHS生成异羟肟酸。其他淬灭

方法包括加20-50mMTris，赖氨酸，甘氨酸或乙醇胺，然而这些伯胺包含修饰蛋白1的化合物。

7.通过脱盐柱去除多余的淬灭试剂。

（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）

1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutylchloroformatemethod）

偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixedacidanhydride),然

后与蛋白分子中的氨基形成肽键。

氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法

(1)5．8mgMIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30

分钟。

(2)1.5mg酶用2ml50mmol/LNa2CO3溶解。

(3)10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。

(4)过sephadexG-25层析柱，柱用含NaCl100mmol/L、MgCl210mmol/L、2-巯基乙醇10mmol/L的

50mmol/LTris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含

BSA0.1％（w/v）、NaN