基因表达的检测的几种方法.pdf

基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、细胞

的RNA的绝对表达量.可以先从样本中抽提RNA,再标记RNA,

然后将这些标记物作探针与芯片杂交,就可得出原始样本中不同

RNA的量.然而用于杂交的某个特定基因的RNA的量与在一个

相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂,它取决于多种

因素,包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列.所以芯

片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种RNA的相对表

达量.样本之间某个基因表达的差异性〔包括表达的时间、空间

特性与受干扰时的改变〕是基因表达最重要的,而了解RNA的绝

对表达丰度只为进一步的应用或多或少地起一些作用.

基因表达的检测有几种方法.经典的方法〔仍然重要〕是根据在

细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一

特定基因是否表达.随着大分子分离技术的进步使得特异的基因

产物或蛋白分子的识别和分离成为可能.随着重组DNA技术的

运用,现在有可能检测．分析任何基因的转录产物.目前有好几种

方法广泛应用于于研究特定RNA分子.这些方法包括原位杂

交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打点．S－1核酸酶分

析和RNA酶保护研究.这里描述RT-PCR从RNA水平上检查基

因表达的应用.8f3f-|2LKb7]-~-|

RT-PCR检测基因表达的问题讨论

关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展,在此

主要讨论它在应用中的问题.理论上1μL细胞质总RNA对稀有

1/8

mRNA扩增是足够了〔每个细胞有1个或几个拷贝〕.1μL差不

多相当于50－100,000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含

RNA的数量,靶分子的数量通常大于50,000,因此扩增是很容易

的.该方法所能检测的最低靶分子的数量可能与通常的

DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子.当已知量的转

录RNA〔用T7RNA聚合酶体外合成〕经一系列稀释,实验结果

表明通过PCR的方法可检测出10个分子或低于10个分子,这是

反映其灵敏度的一个实例.用此技术现已从不到1个philadelphia

染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转

录子.因此没必要分离polyA+RNA,RNA/PCR法有足够的灵敏度

来满足绝大多数实验条件的需要.

7H+F_*S6Wa8p:[,-d,{

将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应,可简化

实验步骤.我们发现整个反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于

或优于先用反转录缓冲液合成CDNA,然后PCR缓冲液进行

PCR扩增循环.当然,值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一

条DNA链的合成.我们对不同的缓冲液用于大片段DNA合成是

否成功还没有进行过严格的研究.

反转录酶的选择似乎对实验方法成功与否并不十分重

要.BRL和BOEHRINGERMANNHEIM的MULV反转录酶进

行全面的研究,但没有理由认为来源可靠的反转录酶不能适用于

该方法.在研究中,我们仅使用了PERKINELMER/CETUS公司

2/8

生产的TAQ聚合酶.

cDNA第一条链的合成可用不规则六聚体、寡聚dT或

PCR下游引物来启动反应.如果用寡聚dT,一般每次反应加

0.