DNA提取和制备学习课件.pptVIP

1~4ml培养细菌收集细菌破裂溶解染色体基因组和蛋白质变性、质粒变性变性的细菌基因组形成网状、蛋白质变性、质粒复性SolutionISolutionIISolutionIII分离、纯化质粒DNA碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分:

(mainregeantsandcomponents)SolutionI:Tris-HCl;EDTA;glucoseSolutionII:NaOH;SDSSolutionIII:CH3COOH碱裂解提取质粒可能存在的问题少量纯化质粒是，多少菌液比较合适？2ml细菌可获得10~15μg质粒加入SolutionII后溶液应该澄清，如出现浑浊可能存在的情况？菌体量过大菌液与SolutionI混合不充分在热或碱的条件下时间过长会导致什么结果？质粒的超螺旋结构不可逆变性如：环状DNA不能被限制酶酶切迁移速率在凝胶中是超螺旋近2倍Br染色较弱等（二）煮沸裂解法（boiling）将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA,然后回收上清液中的质粒DNA煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质粒。对于会释放出大量糖类的菌株不适宜。如HB101及衍生菌。（三）SDS裂解法将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，再用SDS裂解去壁细胞，从而温和地释放质粒到等渗液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA。由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。（四）其它方法2、牙签少量制备法1、小量一步提取法1、小量一步提取法直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA。本法简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。（二）牙签少量制备法用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA。由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。质粒DNA的纯化１.CsCl-EB法２.聚乙二醇沉淀法３.柱层析法EB—CsCl密度梯度离心法EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有0.085g/cm3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。超速离心将介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在下，蛋白质的密度最小位于最上层；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中间，由于不同结构的DNA与EB结合度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的DNA区分开。琼脂水解酶：将含DNA的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA（二）从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回收几种DNA片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。DNA提取试验中常遇到的问题基因组DNA收率较低或无基因组DNA样本材料太少细胞破裂不够充分，DNA释放不完全离心力偏小两相分离不完全……DNA降解的原因样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因组DNA盐浓度过高基因组DNA中乙醇未清除净基因组DNA中可能存在其他抑制因素提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因加入多糖，保护DNA长度质粒DNA制备

plasmidextraction质粒简介

质粒(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等。已经在形形色色的细菌类群中发现质粒.这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。ChromosomeD