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NY_T2744-2015马铃薯纺锤块茎类病毒检测核酸斑点杂交法.doc
ICS65.020BB16中华人民共和国农业行业标准NY/T铃薯纺捶块茎类病毒检测核酸斑点杂交法DetectionofppotatospindletuberviroiW(PSTVd)_Nucleicacidspothybridization(NASH)2015-05-21viroiW(PSTVd)_Nucleicacidspothybridization(NASH)2015-05-21发布2015-08-01实施中华人民共和国农业部发布刖本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。
本标准由农业部种植业管理司提出并归口。
本标准起草单位:农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心(哈尔滨）、中国农业科学院植物保护研究所、黑龙江八一农垦大学。
本标准主要起草人:邱彩玲、刘尚武、张志想、吕典秋、白艳菊、李世访、王绍鹏、魏琪、董学志、耿宏伟、万书明、金光辉、高艳玲、郭梅、闵凡祥、王亚洲、杨光辉、王晓丹、申宇、张威、范国权、张抒、宿飞飞、李勇、胡林双、马纪、刘振宇、高云飞、杨帅、李学湛。
马铃薯纺锤块茎类病毒检测核酸斑点杂交法1范围本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒(PotatoSpindleTuberViroid，PSTVd)的检测方法。
本标准适用于马铃薯的马铃薯纺锤块茎类病毒的检测。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB7331马铃薯种薯产地检疫规程GB18133马铃薯种薯NY/T马铃薯纺锤块茎类病毒检测3原理经过标记的PSTVd探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针，鉴定马铃薯组织是否感染PSTVd。
4试剂与材料以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水。
4.1CHC13(三氯甲烷）。
4.2正电荷尼龙膜((Hybond--NN+)。
4.+)。
4.3抗地高辛-AP(Anti-Digoxigenin-AP)。
44.4CDP-Star(化学发光法使用）。
54.5XX光片(化学发光法使用）。
.4.66显影液、定影液(化学发光法使用）。
4.7Tween-20(C58H114O26，聚氧乙烯去山梨醇单月桂酸酯）。
4.8杂交液。
市售。
4.9lox阻断液。
市售。
.4.10提取缓冲液。
在160.0mL蒸馏水中依次加人NaCl11.7g、MgCl20.4g、醋酸钠(CH3C〇ONa)8.21g、无水乙醇40.0mL和十二烷基磺酸钠（SodiumDodecylSulfate，SDS)6.0g,用HC1或NaOH调节pH至6.0。
.4.1120倍柠檬酸缓冲液储备液（20XSSC储备液）。
在800mL水中加人NaCl175.3g、柠檬酸钠88.2g，加人数滴10mol/LNaOH溶液调节pH至7.0,加水定容至1L，分装后高压灭菌。
或者选择市售商品。
.4.1210%SDS。
在80mL水中加入SDS10g，溶解后定容至100mL。
4.132XSSC/0.1%SDS。
在35.6mL蒸馏水中加入20倍柠檬酸缓冲液储备液(4.11)4mL，10%SDS(4.12)400pL，混勻。
4.140.1XSSC/0?1%SDS。
在39.4mL蒸馏水中加入20倍柠檬酸缓冲液储备液（4.11)20010%SDS(4.12)400pL，混匀。
4.15马来酸缓冲液。
在800mL水中加人马来酸(顺丁烯二酸，CC4HH4〇4)11.607
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