1.2-DNA重组技术的基本操作程序.ppt

基因工程的操作程序1.目的基因的获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取（一）目的基因：1、从基因文库中获取目的基因⑴基因文库的构建①基因组文库的构建②cDNA文库的构建2、利用PCR技术扩增目的基因

（聚合酶链式反应）⑴原理：⑵条件：⑶过程：3、人工合成目的基因⑴通过DNA合成仪人工直接合成⑵反转录法二、基因表达载体的构建1、基因表达载体的组成2、基因表达载体的构建目的3、基因表达载体的构建步骤三、将目的基因导入受体细胞3、将目的基因导入微生物细胞四、目的基因的检测与鉴定1、检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译2、鉴定:功能活性鉴定抗性鉴定思考题1、作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？2、利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？**课前小考1基因工程的工具————，————，——————2分子手术刀的作用部位：——————，特性——————3功能：——————————————————————4分子缝合针作用部位：——————，5与DNA聚合酶的区别与联系————————————————————————6运载体的条件：——————————基因工程的基本操作程序（二）获取目的基因的方法：主要是指编码蛋白质的结构基因。1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、人工合成目的基因提取某生物全部DNA限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库逆转录酶单链DNADNA聚合酶双链DNA与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库mRNADNA分子的半保留复制Tap酶(热稳定的DNA聚合酶)、模板DNA、DNA引物、4种脱氧核苷酸高温变性（90～95℃）低温退火（55～60℃）中温延伸（70～75℃）1988年，穆里斯等人发明的PCR扩增仪蛋白质的Aa顺序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因条件：目前仅限于合成核苷酸相对较少的一些简单基因，而且必须事先清楚它们的核苷酸序列目的基因的mRNA单链DNA双链DNA即目的基因反转录合成练习：解读：P7例11例12P8例14例15P9变式——基因工程的核心⑴目的基因⑵启动子⑶终止子⑷标记基因⑴用一定的限制酶切割质粒⑵用同种限制酶剪切获得目的基因⑶将目的基因插入到质粒的切口处，再加入DNA连接酶，使两者结合成重组质粒。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传，同时使目的基因能够表达。练习：P149---12三、将目的基因导入受体细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程导入植物细胞：方法：⑴农杆菌转化法⑵基因枪法⑶花粉管通道法导入动物细胞：显微注射技术导入微生物：Ca2+处理方法⑴农杆菌转化法⑶花粉管通道法⑵基因枪法显微注射技术目的基因的表达载体提纯受精卵（卵）输卵管（子宫）过程：显微注射胚胎移植大肠杆菌Ca2+处理感受态细胞加入重组表达载体转化增加细菌细胞壁的通透性四、目的基因的检测与鉴定从分子水平检测首先：检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因方法：DNA分子杂交技术原理：碱基互补配对原则工具：基因探针（是指用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子）其次：检测目的基因是否转录出了mRNA，方法：分子杂交技术工具：基因探针最后，检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：抗原---抗体杂交从个体水平检测看转基因生物是否具抗性及抗性的的程度DNA分子杂交技术DNA分子杂交技术抗原—抗体反应不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。**