基因测序(一代测序和二代测序)-用于临床疑难病原体鉴定 (2).pptx

基因测序（一代测序和二代测序）用于临床疑难病原体鉴定;一、一代测序序用于临床疑难病原体鉴定;一代测序，一次测序一个基因，片段1000bp，约30元/样本。

我们2010年以来，将一代测序技术应用于临床疑难细菌真菌鉴定，取得较好效果并发表SCI论著1篇。

第一部分将结合我们的工作进行介绍。;二、二代测序用于临床疑难病原体鉴定;;;细菌核糖体基因结构特征;真菌核糖体基因结构特征;细菌真菌DNA快速提取;细菌真菌核糖体基因PCR扩增

细菌通用引物序列：ccagcagccgcggtaatacg和atcgg(c/t)taccttgttacgacttc，扩增16SrRNA基因，片段996bp。

真菌通用引物序列：gtgaatcatcgaatctttgaac和tcctccgcttattgatatgc，扩增ITS2基因，片段194bp-494bp。;经电泳检测，PCR产物条带亮（产量高），无杂带

（纯度高）。

提供100μlPCR产物、扩增用引物，送公司测序。

公司负责PCR产物纯化及浓缩，双向测序，序列拼接，网上接收测序结果电子版。;PCR产物序列blastn分析流程;一代测序用于临床疑难病原菌鉴定;;;;;;;;;;?24;;WHO推荐GeneXpert效果最佳;结核分枝杆菌测序图;龟分枝杆菌测序图;;;诺卡菌属测序图;;放线菌测序图;;生氮二氧化碳嗜纤维菌测序图;难鉴定细菌分子诊断案例;根癌农杆菌测序图;难鉴定细菌分子诊断案例;有些不同属种的细菌可能有着相同的16SrRNA基因序列，如布鲁氏菌和人苍白杆菌。

增加16S-23SrRNA基因间隔区测序：因变异性大可用于16SrRNA基因不能鉴别的非常接近的不同属种或同一属不同种的鉴定。但有些不同属种仍然不能区分。;增加病原体其他特异基因测序：检索文献不同病原体选取不同特异基因，如布鲁氏菌表面蛋白omp31基因扩增、测序及序列分析。

无菌性标本可直接扩增16SrRNA基因并测序。

也可直接扩增病原体特异基因并测序。;;;;;马尔尼菲青霉菌测序图;难鉴定真菌分子诊断案例;黑曲霉菌测序图;难鉴定真菌分子诊断案例;黄曲霉菌测序图;镰孢菌测序图;难鉴定真菌分子诊断案例;二、基因测序用于临床疑难病原体鉴定;;;;;二代测序适用范围;二代测序适用范围;二代测序优势（提高阳性率）;二代测序优势（快速筛查病毒感染）;二代测序案例分析;38项感染病原检测(6周之内)

5种抗生素先???联用

诊断不清、治疗

无效、束手无策;48小时

完成脑脊液标本二代测序

提示钩端螺旋体感染

475条序列，占比0.016%

改用青霉素治疗

32天

男孩痊愈出院;;;;;二代测序优势;二代测序存在污染问题;二代测序存在污染问题;一代测序用于可培养的疑难病原体鉴定

细菌常选择16SrRNA基因，真菌常选择间隔区ITS1和ITS2，PCR扩增及一代测序，30元/样本，可作为临床细菌真菌检验的常规补充方法。

二代测序用于难培养或不可培养的疑难病原体鉴定

适合难培养的细菌真菌，尤其适合病毒、螺旋体、寄生虫等无法培养的病原体，直接对标本进行二代测序、可快速检测1万多种病原体，3000元/样本。;