姜黄素调控KLF2表达对BV2细胞OGD模型中的作用及机制.doc

姜黄素调控KLF2表达对BV2细胞OGD模型中的作用及机制

缺血性脑卒中(Ischemicstroke,IS)占脑卒中总数的70%～80%,具有高发病率、病死率、致残率、复发率及年轻化趋势等特点[1],已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。IS发生机制主要包括炎症反应、氧化应激损伤、铁死亡、细胞焦亡等,其中炎症反应是关键机制之一。小胶质细胞作为中枢神经系统的免疫效应细胞,在调控神经炎症方面发挥关键作用。研究表明脑缺血再灌注损伤后,脑缺血区小胶质细胞过度激活,加剧炎症因子的释放,导致脑缺血损伤导致神经元死亡[2]。Kruppel样因子2(Kruppel-likefactor2,KLF2)是一类具有锌指结构域的核转录因子,结合靶基因启动子GC富含序列,调控相应基因的表达[3]。研究表明激活KLF2能抑制内皮细胞及巨噬细胞分泌的炎症因子、趋化因子的表达,发挥抗炎作用[4]。姜黄素(Curcumin)是姜黄根茎的主要生物活性成分,有天然的抗氧化性、抗炎特性和抑制凋亡等多种生物学功能[5]。研究证实姜黄素对IS具有神经保护作用,但具体作用机制仍未明确[6]。本研究拟通过(Oxygen-GlucoseDeprivation,OGD)模型模拟神经元缺血缺氧环境诱导BV-2小胶质细胞活化,观察姜黄素对BV-2小胶质细胞损伤后的抗炎作用,探讨KLF2是否介导姜黄素治疗IS的神经保护作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1BV2细胞。小鼠源性BV2细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,批号SCSP-5208)。

1.1.2试剂与仪器。姜黄素(长沙鼎国生物技术有限公司),胎牛血清(美国Gibco公司),DMEM细胞培养基(美国Gibco公司),MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、ELISA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),KLF2-siRNA(上海吉玛制药技术有限公司),Lipofectamine2000试剂(美国Invitrogen公司),KLF2抗体(abs124444)、p-NF-κB抗体(SAB4301496)、NF-κB抗体(SAB4502615);酶标仪(美国BioTek公司)、FormaSteri-Cycle型CO2细胞培养箱(美国赛默飞公司)、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养。BV2细胞采用含4.5g/L葡萄糖和10%胎牛血清的新鲜DMEM培养基在37℃、95%氧气、5%CO2细胞培养箱进行培养,观察细胞密度达到约90%以上进行消化,按1∶4比例进行传代培养。

1.2.2OGD建模及处理。将BV2细胞随机分为正常培养的对照组(Control组)、氧糖剥夺模型组(OGD组)、姜黄素干预组(Cur组)。对照组在培养箱中正常培养细胞,模型组加入无糖DMEM培养基在37℃、95%氮气、5%CO2环境中培养2h,然后更换含糖DMEM培养基并置于37℃、5%CO2环境中孵育24h。姜黄素组在构建OGD模型后采用不同浓度(1、5、10、20μmol/L)的姜黄素处理BV2细胞24h。

1.2.3噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT)检测BV2细胞活力。将细胞接种于96孔细胞培养板,每孔细胞密度5×104个,每组各孔加入20μL的MTT溶液,37℃孵育4h,3000r/min离心5min,吸取并弃去上清液,各孔再加150μL二甲基亚砜(DMSO)溶解,振荡混匀10min,使用酶标仪在490nm波长处测定其吸光度(OD)。细胞活力=(OD值实验组-OD值空白组)/OD值空白组,其中OD值实验组为实验组的吸光度,OD值空白组为空白组的吸光度。

1.2.4Westernblot检测KLF2、p-NF-κB、NF-κB蛋白表达水平。将BV2细胞接种于6孔细胞培养板,细胞密度为106个/孔,加入600μL细胞裂解液,冰上裂解5min,用细胞刮轻轻刮下细胞,收集于离心管中,4℃离心5min,取上清蛋白溶液,进行蛋白定量检测,采用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳后,切胶、转膜,5%脱脂牛奶封闭2h,加入KLF2、p-NF-κB、NF-κB抗体(1∶1000),4℃孵育过夜。用1×TBST洗膜3次,每次10min,加入稀释后的二抗溶液(1∶5000),室温孵育1h,洗膜3次,用化学发光法分析仪显影,使用ImageJ软件进行条带灰度值分析。

1.2.5细胞转染。将BV2细胞接种于6孔细胞培养板,细胞密度为106个/孔,24h后,分别加入KLF2-siRNA或乱序-siRNA(SC-siRNA)孵育6h后,然后根据转染试剂说明书步骤,使用Lipofectamine2000试剂进行辅助转染,37℃