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酵母单杂交实验步骤总结--第1页

1pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）

载体的构建（酵母报道子的构建）

注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，

r

且插入到pAbAi载体AbAi报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含

目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于

长度小于20bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。

的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。

1

（）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与

pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列

作为对照，以排除可能的假阳性）。

2TEbuffer100mol/L

（）用溶解寡核苷酸至终浓度m。

31:1

（）将正向链和反向链按照的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度

为50mol/L）。

m

495C30s

（）保温，去除二级结构。

°，去除二级结构。

572C2min37C2min25C2min

（）°保温，°保温，°保温。

注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。

注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。

6-20C

（）冰上放置。退火后的产物可贮存在冰箱备用。

°冰箱备用。

71LpAbAi

（）酶切载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。

m载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。

注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。

注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。

81000.5mol/L

（）将退火后的寡核苷酸稀释倍至终浓度为m。

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（）在连接反应管中加入如下成分：

在连接反应管中加入如下成分：

pAbAi载体（50ng/L）1.0L

mm

annealedoligonucleotide0.5mol/L1.0L

（m）m

1T4DNAligasebuffer1.5L

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