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烟草SMC1A基因克隆、表达载体构建及表达分析

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卢健荣

摘要：采用同源克隆的方法对烟草品种K326中的一个SMC1A基因进行了研究，组织表达分析发现，该基因在成熟期的根、茎、叶、花中均有表达，在根中的表达量最高。有研究表明，该基因的稳定表达对低钾、高盐、干旱、ABA均有响应表达，试验成功构建了pET32a-SMC1A过表达载体。研究结果能为解析SMC1A在响应逆境胁迫的功能奠定一定理论

基础.

关键词：烟草SMC1A克隆生物信息学基因表达

染色体结构维持蛋白（SMC蛋白，structuralmaintenanceofchromosomeproteins），与染色体结构细胞周期性的动态变化紧密相关，它们参与有丝分裂染色体的集缩和分离、性染色体的剂量补偿效应、姐妹染色单体的内聚作用、遗传重组和DNA修复等过程[1]，具有一定的结构保守性，可作用于染色体代谢的多个方面。

SMC蛋白普遍存在于各种生物中，尽管不同种类SMC蛋白的结构有差异，但是它们具有一定的保守性[2]。通常，SMC蛋白是由1000到1500个氨基酸残基组成的多肽并具有共同的结构特征：N端核苷结合基序，中间两个被铰链隔开的螺旋区（可能与蛋白质之间的相互作用有關），C端被命名为DA盒的保守序列。DA盒与ATP酶的特征基序非常相似，DA盒和N端ATP结合区共同组成ATP酶功能域，因此SMC蛋白是一类染色体ATP酶。

许多原核生物（包括细菌、古细菌）也具有编码SMC蛋白的基因。革兰氏阳性细菌枯草杆菌SMC基因的突变会导致无类核细胞的形成、类核结构的破坏以及与染色质分离相关的蛋白复合物的错误组装，这说明枯草杆菌的SMC基因产物与类核物质的压缩直接相关[3～5]。

SMC蛋白与染色体行为密切相关，它与不同亚基结合在多个方面影响染色体，本实验拟通过克隆烟草SMC1A基因，分析进行其遗传特性学及其生物信息学特性分析，为研究烟草基因组稳定性奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

烟草品种K326；原核表达载体pET-32a（+）；rans5α化学感受态细胞和BL21（DE3）化学感受态细胞（购自北京全式金生物技术有限公司）；T4DNALigase、EcoRI-HF?和NotI-HF?限制性核酸内切酶（NewEnglandBiolabs（NEB）公司）；胶回收试剂盒和质粒小提中量试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）

1.2方法

1.2.1SMC1A基因引物设计与合成

参考NCBIGenBank基因库中SMC1A（NM_019710.2）基因序列设计引物，引物设计如下：

MC1A-F：ATGGGTTTCCTGAAACTGAT

MC1A-R：GCTATTGTTCATTGGGGTTGG

所设计引物送生物公司进行合成。取烟草品种K326叶子，提取总RNA，进行反转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR），转录成cDNA，保存于-80℃冰箱。

通过PCR扩增其基因，克隆至质粒载体，对克隆得到的编码基因进行PCR鉴定及测序鉴定。具体体系和反应条件如表1所示。

反转录成cDNA后，参照2×TransTaqHighFidelity（HiFi）PCRSuperMixⅡ说明书的体系要求分别加入试剂，具体试剂参见表2所示。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。条带正确则将目的位置PCR产物电泳条带胶回收纯化，胶回收方法具体操作参考天根胶回收试剂盒说明书进行。

1.2.2重组质粒的构建及鉴定

1.2.2.1目的基因与表达载体连接

将转有原核表达载体pET-32a（+）的细菌过夜培养，提取pET-32a（+）载体质粒，提取方法见说明书。取pET-32a（+）质粒和纯化后的PCR产物，分别加入预先准备好的EcoRI-HF?和NotI-HF?限制性内切酶进行双酶切，反应条件为37℃4h，65℃15min，具体体系和反应条件参考表3和表4。反应结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳，并参考天根胶回收试剂盒对产物进行纯化，具体操作参考说明书进行。回收后的样品按摩尔比，载体：插入的DNA=1：7的比例加入，并添加1μLT4DNALigase和2μL10×buffer，1μLNuclease-FreeWater，总体系为20μL。置于4℃过夜反应。

1.2.2.2转化

反应结束后，向反应液中加入50μLTrans5α化学感受态细胞，反应条件为冰浴20～30min，42℃热激1min30s，冰浴2min，然后加入200μL无氨苄青霉素LB液体培养基，于摇床上37℃，200rpm培养1-2h，再将菌液涂布于含氨苄青霉素LB固体培养基上，置于37℃培养箱中过夜培养。第二