质粒DNA提取、定量、酶切与PCR鉴定.pptVIP

数据处理测量次数质粒DNA浓度(μg/ml)Ratio值(A260/A280)123平均值定量检测第三部分酶切鉴定

DNARestrictionEnzymeDigestion限制性内切酶（restrictionendonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具。特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制性内切酶★平末端

在识别顺序的中心对称轴处切割5’G-G-C-C3’3’C-C-G-G5’5’G-G3’C-C-C-C3’-G-G5’HaeIII限制性内切酶★3’端粘性末端

在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’末端切割。5’G-G-T-A-C-C3’3’C-C-A-T-G-G5’G-G-T-A-C3’CC3’C-A-T-G-GKpnI限制性内切酶5’G-A-A-T-T-C3’3’C-T-T-A-A-G5’GC-T-T-A-A5’5’A-A-T-T-CGEcoRI★5’端粘性末端

在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5’末端切割。5’A-A-G-C-T-T3’3’T-T-C-G-A-A5’AT-T-C-G-A5’5’A-G-C-T-TAHindIII限制性内切酶双酶切限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；限制性内切酶Buffer的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20ul。以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，可分解15μg的DNA。限制性内切酶影响酶切反应的因素底物DNA的纯度：主要污染DNA的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应;反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+,合适离子强度可以激发酶切反应;反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%;保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;限制性内切酶1.菌液：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD18-T)实验材料目的片段400bp酶切片段大小为?酶切位点酶切位点PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。什么是PCR？定义变性95?C延伸72?C退火Tm-5?C溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链实验原理5?Primer15?Primer2Cycle2Cycle15?5?5?5?5?5?TemplateDNA5?5?5?5?5?5?5?5?原理示意图Cycle35?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。PCR仪(BioRadMJmini)小型台式离心机（Sigma1-14）微量加样枪灭菌的薄壁离心管实验仪器1.菌液：大肠杆菌D