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苜蓿根腐病锐顶镰刀菌鉴定方法

1范围

本文件规定了苜蓿锐顶镰刀菌根腐病鉴定的主要仪器与用具、主要试剂与材料、实验室检测、结果判定。

本文件适用于苜蓿锐顶镰刀菌根腐病的室内鉴定。2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

锐顶镰刀菌根腐病fusariumacuminatumrootrot

由锐顶镰刀菌（Fusariumacuminatum）引起的苜蓿根腐病，在感染初期，苜蓿的根皮附近会出现褐色或暗褐色的坏死斑，根系毛根减少，部分叶子出现黄叶，发病严重时叶片枯黄，植株根部的中柱腐烂霉变，并发生坏死，根茎出现中空，侧根出现大量腐烂坏死，分枝减少。

4主要仪器与用具

光学显微镜、摇床、培养箱、超净工作台、高速冷冻离心机、PCR仪、培养皿、酒精灯、血球计数板、解剖刀、接种针、移液器、枪头、离心管。

5主要试剂与材料

5.1试剂

5.1.1次氯酸钠。

5.1.2无水乙醇。

5.1.3硫酸链霉素(500mg/mL)。

5.1.4真菌基因组提取试剂盒。

5.1.5PCRSuperMix。

5.1.6凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，LoadingBuffer，DL2000DNAMarker。5.2培养基

5.2.1水琼脂培养基（WA:WaterAgar）：琼脂粉15g，加蒸馏水定容至1000mL，121℃高压湿热

灭菌20min。

5.2.2马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA:PotatoDextroseAgar）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，加蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。

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5.2.3马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB:PotatoDextroseBroth）：马铃薯200g，葡萄糖20g，加蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。

5.2.4绿豆琼脂培养基（MBA:MungBeanAgar）：绿豆粉60g，琼脂粉15g，加蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。

6实验室检测

6.1病原菌的分离和纯化

6.1.1病原菌的分离

从苜蓿田采集患有根腐病的典型病株。用水清洗样品表面的砂砾和土壤，从根部病健交界部位切成约0.5cm×0.5cm的小组织块，用75%酒精和1%次氯酸钠分别处理3min和5min，无菌水清洗5次。把表面消毒的发病组织放在PDA培养基上25℃培养，见附录A中的图A.1。

6.1.2病原菌的纯化

待PDA培养基长出菌落后取菌落边缘的菌丝转接3次后再进行单孢分离获得纯化菌株用于后续试验，见附录A中的图A.1。用30%灭菌甘油将分离鉴定后的菌株于-80℃保存，对不需长期保存的菌株及时灭活处理。感染苜蓿根腐病的样品保存于4℃冰箱中，以备复核。

6.2菌落培养特性和病菌形态特征鉴定

6.2.1锐顶镰刀菌在PDA培养基生长形态

锐顶镰刀菌在PDA平板上菌丝呈粉红色绒毛状，生长到后期，颜色逐渐加深变成桃红色，菌丝有隔且具分支，见附录A的图A.2。

6.2.2锐顶镰刀菌分生孢子

锐顶镰刀菌小型分生孢子数量较少，呈长椭圆形，0～1个分隔，大小为6.8μm～14.0μm×3.5μm~

4.9μm。大型分生孢子数量较多，弯刀型，中间较宽、较胖，两端稍尖并稍弯曲，2～5个分隔，大小为

18.2μm～38.5μm×3.9μm～6.3μm，见附录A中的图A.3。6.3分子鉴定

6.3.1病原菌基因组DNA的提取

病原菌菌株在25℃下PDA平板上生长5～7d后，转接至装有50mL的PDB培养基静置生长3d，离心收集菌丝，液氮下研磨，使用真菌基因组提取试剂盒提取病原菌DNA后进行分子生物学鉴定。

6.3.2PCR检测鉴定6.3.2.1引物

采用rDNA-ITS区通用引物ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)和RPB2基因通用引物fRPB2-7Cf(5-ATGGGYAARCAAGCYATGGG-3)和fRPB2-11aR(5-G

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CRTGGATCTTRTCRTCSACC-3）以及镰刀菌PHO序列引物Fusphoo-f(5-ATGCARGGYATYGGHCARCTHGT-3)和Fusphoo-r(5-ACRTTRGTRGCATCCTTRGWRGART-3)进行PCR扩增。

6.3.2.2PCR结果