生化工程实验.pptVIP

一、实验目的(1)通过超氧化物歧化酶的分离纯化,了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换层析方法的原理。(2)掌握测定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。二、原理超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)简称SOD,它广泛存在于各类生物体内,按其所含金属离子的不同,可分为3种:Cu·Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。SOD催化如下反应:O2.-+O2-+2H+→H202+02------自由基清除剂实验一、SOD酶粗酶液的分离纯化

分离纯化的原理?（1）Mn-SOD易溶于乙醇；（2）K2HP04极易溶于水；（3）极性有机溶剂丙酮沉淀SOD;(4)纤维素阴离子交换柱纯化。X＋X＋X＋X＋X＋X＋Y＋X＋Z＋X＋Y＋Z＋Z＋Y＋Y＋Y＋X＋Z＋X＋Z＋X＋Z＋Z＋X＋X＋X＋Y＋Z＋Y＋Z＋Ｘ＋Ｘ＋X＋X＋X＋X＋Ｚ＋X＋Ｚ＋X＋X＋OH－nX＋平衡上样吸附洗杂洗脱离子交换法（2）根据分子电离性质的差异性进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。三、实验步骤：1、粗酶液的获得：收集50mL发酵液菌体，离心收集菌体。15mL磷酸钾缓冲液重悬菌体，并加入75ulTriton冰上裂解菌体10min，超声破碎（400w,5’’-3’’,90次），8000rpm离心10’，上清即为SOD粗酶液,取上清12ml（留样1mL测酶活和蛋白含量--A）。2、氯仿去蛋白：上清中缓慢加入1/4体积的4℃下预冷过的95%乙醇3mL,然后再缓慢加入在4℃下预冷过的氯仿1.8mL(0.15倍体积),充分搅拌,8000rpm离心10min,弃去沉淀,收集上清液约10mL(留样0.5mL测酶活和蛋白含量---B)。3、K2HP04去水：加入K2HP04·3H20(按43gk2HP04·3H20/100mL粗提液的比例),约4g充分振摇，静止分层，收集上层，离心8000rpm，10min,弃沉淀,得上清液约8mL(留样0.5mL测酶活和蛋白含量-C)4、丙酮沉淀蛋白并透析：上一步得到的上清液加入0.75倍体积在4℃下预冷过的丙酮,Mn-SOD便沉淀下来。离心8000rpm，10min,收集灰白色沉淀物。将沉淀物溶于约3mLddH2O中,在4℃下,对250mLpH7.6,2.5mmol/L的磷酸钾缓冲液透析,每隔20’以上,换透析外液1次,共换2-3次。透析内液如出现沉淀,需8000rpm，10min,弃去沉淀,收集上清液约5ml(留样0.3mL-D)。5、DE-52纤维素柱层析：将上一步所得离心上清液过DE-52纤维素柱。用pH7.6,2.5mmol/L磷酸钾缓冲液作层析柱平衡液,用pH7.6,2.5mmol/L(100mL)-200mmol/L(l00mL)的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱。流速30mL/h,每管收集3mL,记录总体积。实验二、SOD蛋白浓度及酶活测定一、实验目的掌握蛋白含量和SOD酶活性的测定方法。二、原理酶的比活性用每毫克蛋白质具有的活性单位来表示，因此，测定样品的比活性必须测定：（1）每毫升样品中的蛋白质毫克数。（2）每毫升样品中的酶活性单位数。SOD测定方法采用邻苯三酚自氧化法:邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物。中间物在420nm波长处有强烈光吸收,当有SOD存在时,由于它能催化O2-与H+结合生成02和H202,从而阻止了中间物的积累,因此,通过计算就可求出SOD的酶活性。非变性电泳分离胶配方分离胶10%共12mlH2O5ml30%凝胶贮存液4ml4X分离胶缓冲液（PH=8.8）3ml10%过硫酸铵200ulTEMED16ul非变性电泳浓缩胶配方浓缩胶4.5%共8mlH2O4.8ml30%凝胶贮存液1.2ml4X浓缩胶缓冲液（PH=8.8）2ml10%过硫酸铵100ulTEMED10ul三、实验步骤1.测蛋白标准曲线的绘制（1）蛋白标准样0.4mg/ml：立即混匀，室温放置2-3分钟，595nm比色，空白管调零。（2）计算出各阶段样品的蛋白浓度。mlABCDE空白蛋白标准样ml0.050.100.150.200.25DD水0.200.150.100.050.25G2505.05.05.05.05.05.0三、实验步骤1.卡马斯亮蓝法测蛋白（1）取7只试管，编号，按下表