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引物设计吴亚滨经验汇总引物长度。15-30bp，通常18-27bp，不应大于38bp。PCR产物长度。200-1000bp为宜。GC含量。一般40%-60%。上下游引物GC含量不应差别太大。退火温度。理想下，引物对的退火温度应相同，但相差4℃-6℃不想pcr产率，可以再55-75之间变化。错配。1.看错配导致的结果。2.错配的△G。二级结构1.Dimer及hairpin能值不应大于4.5Kcal/mol。2.引物自身和引物之间不能有4个连续碱基互补。3.3′端重要。避免有发卡结构，及超过三个的互补碱基；不应出现3个的连续碱基，最好不要出现A。●△G1.3′端△G低，绝对值不要超过9；5′端和中间相对较高。2.3′端最后5个核苷酸的稳定性大于9时，通常是专一性的探针或引物，3′端越不稳定，假引发的可能性越小。常用的PCR引物设计软件Oligo6（功能强大）Primer5.0（常用）OmigaDnastarPrimer5.0操作简单，设计出的引物可以在Oligo中进行优劣检测。Primer5.0一个界面primer5.0设计引物中常见问题GC含量过低，百分子二三十；有时过高，六七十。Tm相差远。双引物单独评分高，结合在一起评分低。扩增产物评分低。有时产物片段长。△G绝对值大。引物碱基分布太集中。完
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