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奶绵羊胚胎冷冻解冻技术规程

1范围

本文件规定了奶绵羊体内胚胎形态鉴定与程序化冷冻及解冻技术要点。本文件适用于奶绵羊的体内胚胎程序化冷冻保存及解冻。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T1571羊胚胎移植技术规程

NY/T1674牛羊胚胎质量检测技术规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

奶绵羊dairysheep

以产奶为主要生产方向的绵羊品种。

3.2

胚胎冷冻embryofreezing

将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过一定的降温方式将胚胎保存于液氮中，使其代谢和发育处于暂时停滞状态，解冻后仍能正常发育的一种保存方法。

3.3

植冰seeding

又称诱发结晶，是指在略低于溶液冰点的温度下通过加入冰母或强行冷却的方式诱导溶液结冰。

3.4

胚胎解冻embryothawing

将处于冷冻状态的胚胎进行解冻处理，以恢复胚胎发育能力的过程。

4胚胎形态鉴定

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供体羊发情后的5.5d～6.5d体内生产的胚胎按照NY/T1571使用体式显微镜进行形态学鉴定，形态示意图见附录A。

5胚胎冷冻保存

5.1胚胎冷冻所需器材

体视显微镜、程序化冷冻仪、液氮罐、捡胚管、0.25mL冷冻细管、装管器、玻璃细管、0.22μm细菌滤器、胚胎培养皿、记号笔、低温标签纸。

5.2胚胎冷冻所需溶液

保存液：含0.4%（w/v）牛血清白蛋白的PBS液。冷冻液Ⅰ：含1.5mol/L乙二醇的保存液。

冷冻液Ⅱ：含10%（v/v）甘油的保存液。冷冻液Ⅲ：含6%（v/v）甘油的保存液。冷冻液Ⅳ：含3%（v/v）甘油的保存液。

5.3胚胎操作室要求

温度在20℃~25℃之间，操作前使用紫外灯消毒20min～30min，胚胎操作区域用75%酒精擦拭消毒。

5.4胚胎选择

根据形态选择发育期为早期桑椹胚（EM）、紧缩桑椹胚（CM）、早期囊胚（EB）、囊胚（BL）和扩张囊胚期（EXB）的A（1）、B（2）级胚胎（附录A图A.2、A.3）进行冷冻。

5.5胚胎的洗涤与平衡

5.5.1方法一乙二醇冷冻液冷冻胚胎的洗涤与平衡

胚胎冷冻前用保存液洗涤5次～6次；洗涤后的胚胎放入冷冻液Ⅰ中，室温下平衡15min～20min。5.5.2方法二甘油冷冻液一步法胚胎冷冻的洗涤与平衡

胚胎冷冻前用保存液洗涤5次～6次；洗涤后的胚胎放入冷冻液Ⅱ中，室温下平衡15min～20min。5.5.3方法三甘油冷冻液三步法胚胎冷冻的洗涤与平衡

胚胎冷冻前用保存液洗涤5次～6次；洗涤后的胚胎依次放入冷冻液Ⅳ、Ⅲ和Ⅱ中，每种冷冻液中室温下平衡4min～5min。

5.6胚胎装管

装管方法见附录B，每支装1枚～10枚相同发育期、相同级别胚胎。5.7胚胎记录

在标签纸上打印记录胚胎信息，包括胚胎的母本品种、母本耳号、父本品种、父本耳号、数量、发育期、质量以及冷冻日期，粘贴于细管上。数量、发育期、质量标注方式为XEM/CM/EB/BL/EXB1/2，其中

X表示数量，EM/CM

/EB/BL/EXB表示发育期，下标1/2表示A/B级胚胎级别。如2CM1代表2枚A级紧缩桑椹胚，2CM2代表2枚B级紧缩桑椹胚。

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5.8冷冻程序

5.8.1方法一乙二醇冷冻液冷冻胚胎程序

胚胎冷冻细管由室温直接置入-6.0℃的程序化冷冻仪中，平衡4min～5min后，在-6.0℃时植冰1s～3s，继续平衡5min，然后以-0.3～-0.5℃/min的速率降温至-35℃,平衡10min，取出胚胎冷冻细管，迅速投入液氮罐中保存。同时详细记录胚胎信息，胚胎冷冻信息登记表见附录C表C.1。

5.8.2方法二甘油冷冻液冷冻胚胎程序

胚胎冷冻细管由室温直接置入-6.5℃的程序化冷冻仪中，平衡4min～5min后，在-6.5℃时植冰1s～3s，植冰之后的操作步骤同5.8.1。

6胚胎解冻

6.1胚胎解冻所需器材

水浴锅、其余同5.1（体视显微镜、液氮罐、捡胚管、0.22μm细菌滤器、胚胎培养皿）。6.2胚胎解冻所需溶液

保存液配方同5.2。

解冻液Ⅰ：含0.25mol/L蔗糖的保存液。解冻液Ⅱ：含1mol/L蔗糖的保存液。

解冻液Ⅲ：含0.3mol/L蔗糖+3%（v/v）甘油的保存液。解冻液Ⅳ：含0.3mol/L蔗糖+6