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瘤胃微生物体外培养操作规程

1范围

本文件规定了瘤胃微生物体外培养的规程。

本文件适用于反刍动物瘤胃微生物体外培养。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样

HJ536水质氨氮的测定水杨酸分光光度法3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4试剂和材料

4,1试剂

4.1.1本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。

4.1.2氯化钙CaCl2·2H2O。

4.1.3氯化锰MnCl2·4H2O。

4.1.4氯化钴CoCl2·6H2O。

4.1.5氯化铁FeCl3·6H2O。

4.1.6碳酸氢铵NH4HCO3。

4.1.7碳酸氢钠NaHCO3。

4.1.8磷酸二氢钠NaH2PO4·2H2O。

4.1.9磷酸二氢钾KH2PO4。

4.1.10硫酸镁MgSO4·7H2O。

4.1.11刃天青C12H6NNaO4。

4.1.12硫化钠Na2S·9H2O。

4.1.13氢氧化钠NaOH。4.2试剂配制

4.2.1瘤胃缓冲液的配制

4.2.1.1营养元素溶液A

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准确称量氯化钙13.20g，氯化锰10.00g，氯化钴1.00g，氯化铁8.00g，溶解后定容到100mL。4.2.1.2缓冲溶液

准确称取碳酸氢铵4.00g，碳酸氢钠35.00g，溶解后定容至1000mL。4.2.1.3营养元素溶液B

准确称取磷酸二氢钠5.70g，磷酸二氢钾6.20g，硫酸镁0.60g，溶解后定容到1000mL。4.2.1.4刃天青溶液

将100mg刃天青溶解到100mL水中。4.2.1.5还原剂溶液

需要现配现用，称取硫化钠0.336g，1M氢氧化钠2.0mL，加入47.5mL水。

5仪器和设备

5.1实验室用植物样品粉碎机，筛网孔径16目～32目。5.2分析天平，感量0.0001g。

5.3干燥箱：RT+10℃~250℃,控温精度±5℃。

5.4ANKOMRFS体外产气测量系统：模块数量18个以上，250mL培养瓶。

5.5震荡培养箱（数显水浴震荡培养箱或气浴震荡培养箱）：内径大于30cm×40cm，震荡频率0r/min～100r/min，控温范围室温至99.9℃,温控精度±0.1℃。

5.6pH计：测量范围0～14，精度±0.1。

6操作步骤

6.1培养底物的制备

按照GB/T14699.1制备培养底物，置于干燥箱内65℃烘干，粉碎或研磨后过16目筛，混匀后取100g～200g装入磨口广口瓶内或封口袋内，保存备用。

6.2瘤胃缓冲液配制

取营养元素溶液A0.12mL、缓冲溶液237mL、营养元素溶液B237mL、刃天青溶液1.22mL加入到

474mL水中，通入CO2至饱和，并保存在39℃水浴恒温培养箱中，最后再加入49.5mL还原剂溶液，加水定容至1000mL，继续通入CO2直到溶液由蓝色变成无色。

6.3瘤胃液的制备

选择健康、体重接近的3只（头）装有永久性瘤胃瘘管的供试动物，单栏饲养。在晨饲前经瘤胃瘘管利用瘤胃液取样器采集供试动物的瘤胃液，每只（头）动物采集150mL～200mL,转入预热至39℃的保温容器中。用搅拌器搅拌2min，混合均匀后经4层纱布过滤，同时通入CO2气体，备用。

6.4培养装置的准备

每个培养瓶中加入培养底物约0.5g（准确至0.0001g），每种培养底物设3个重复，每次培养设

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1个空白（只有培养液无底物）。保持所有培养瓶为39.5℃,每个培养瓶加入40mL缓冲溶液，pH调整至6.8，调节缓冲平衡20min～30min。

6.5培养

每个培养瓶中迅速加入20mL瘤胃液。瘤胃培养液通入CO23min，立即拧上瓶盖，放入39.5℃培养箱内培养，培养箱的震荡频率为15次/分，持续培养48h。

7瘤胃微生物体外培养参数测定

瘤胃微生物体外培养参数测定见附录A，包括产气量的记录、pH值测定、氨氮和挥发性脂肪酸的测定和营养物质消失率的测定。

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附录A（资料性）