第三章--基因克隆载体.pptVIP

基因克隆载体(geneclonevector):

通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。也称DNA克隆载体。;必备条件：

1、克隆位点(一个或多个)

2、能携带外源DNA片段进入受体细胞:能自我复制，或整合到染色体随受体细胞DNA复制而复制。

3、有选择克隆子的标记基因

4、安全性(不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞)

意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域。;按克隆载体的来源分：

质粒～

病毒或噬菌体～

质粒与病毒或噬菌体DNA组成的～

质粒与染色体DNA片段组成的～;３.１质粒克隆载体

定义：

以质粒DNA为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、建立基因组文库和cDNA基因文库。

;构型：;２、分子大小： 100～102kb;３、复制

特点：在宿主细胞内进行单向复制。

质粒和宿主细胞双重遗传系统控制复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值）

（１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定。

严紧控制型：1～数个拷贝；大质粒

松驰控制型：10个以上拷贝；小质粒。

经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达3000个）。;;（２）质粒复制的控制因素

cop基因：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续复制。;rep基因：指令宿主合成一种调节蛋白，促进质粒的复制;４、质粒的不亲合性

亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒

不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒。

意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒

;５、质粒迁移

（１）接合质粒：

含tra基因→合成细胞表面物质（鞭毛）→质粒DNA入受体细胞

含tra基因的质粒称为接合质粒。如F、Ti等

不含tra基因的质粒称为非接合质粒。如ColE1、pPbS等

;（２）迁移作用：

不含tra基因而含bom（oriＴ）位点的质粒，当宿主细胞存在辅助质粒mob基因产物时，即可打开oriＴ位点，非接合质粒借助接合质粒tra基因的产物而迁移入受体细胞。这种现象称～;质粒的迁移作用;６、显性质粒和隐蔽质粒

宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表达型）质粒。

显性质粒

Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap/Amp

（抗性质粒）氯霉素Cm/Cap

卡那霉素Km/Kan

四环素Tc/Tet

链霉素Sm;Col质粒（产大肠杆菌素）

Ｆ质粒（引起细胞结合的育性质粒）

降解毒物的降解质粒

Ｔi质粒

隐蔽质粒

蓝藻内源质粒

;二、质粒克隆载体构建的基本策略?

１、克隆位点——组装MCS连杆

２、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝）

３、选择标记基因——抗性基因，(LacZ′基因)

４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb转化率↓↓

５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等;三、质粒克隆载体构建

过程：严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重组）;构建原则：

1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子。

2、正确获得构建质粒克隆载体的元件。

3、组装合适的选择标记基因。

4、选用合适的启动子。

5、构建过程力求简单。;代表性实例

（一）pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建

Ⅰ、pBR322构建※

目标是缩小基因组的体积，移去一些对基因克隆载体无关紧要的DNA片段，限制酶识别位点。

质粒载体命名法则：

“pBR322” p：质粒（plasmid)

BR：两位主要构建者

322：实验编号;ColE1松驰型，筛选系统复杂。衍生的pMB1为出发质粒（松弛型复制起始位点，但缺较好的选择标记基因和克隆位点）。

pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧型，含有Tcr基因。;;构建过程(出发质粒：pMB1);R1（沙门氏菌中分离）变异R1drd19

（含易位子Tn3Apr）

R1drd19Tn3

ColE1

pBR322的三个亲本：pMB1、pSC101、pSF2124

pBR322分子大