DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定.pdf

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定--第1页

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

第二次分子生物学实验报告

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

一、实验目的

1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶

切的操作技术。

2、学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构

建体外重组DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。

3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E.coli的原理与

方法。

4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。

5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；

6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；

7、通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含

有外源目的DNA片段，并验证重组子是期望的重组子。

二、实验原理

1、限制性内切酶

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由

此切割DNA双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。在限制性核酸内切

限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细

菌自己固有的DNA由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降

解。

目前已经鉴定出3种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II型酶和III型酶。

Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。Ⅲ型限制酶的切割位点距识

别序列3端为24—26bp。Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且

具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。

Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA分子双链的特异性识别序列

部位切割DNA分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不

是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。

1/13

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定--第1页

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定--第2页

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

限制性核酸内切酶对DNA底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组

体分子的筛选和鉴定等实验结果。核酸内切限制酶活性的充分发挥受到以下几个因素的

影响：

1）DNA样品的纯度，可采取措施有纯化DNA、加大酶的用量、延长酶催化反应的

保温时间，扩大反应体积；

2）DNA的甲基化程度，基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株；

3）酶切消化反应的温度；

4）DNA的分子结构；

5）限制性核酸内切酶的缓冲液。

限制核酸内切酶是分子克隆中最常用的工具酶，在DNA重组技术中限制性核酸内

切酶主要用在一下几方面：①构建重组质粒；②构建基因文库；③DNA分子的杂交；

④制备DNA放射性探针；⑤绘制DNA分子的限制酶图谱⑥DNA序列分析；⑦基因定

位及DNA同源性研究。

2、限制性内切酶的酶切反应

体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内

切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶